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호흡기질환치료제 개발을 위한 기도내 투여 기술 활용 동물모델

안전성평가연구소 전북분소
김성환 (sunghwan.kim@kitox.re.kr)

생물학적 활성과 각 기관 간의 유기적인 상호작용은 생물에서만 관찰되는 특성으로 이러한 특성이 적용 가능한 동물모델은 인간과 동일한 체내기관 구성과 호흡, 소화, 대사, 생식 시스템이 갖춰 있어 생명 현상을 이해하고 예측하는데 중요한 역할을 하고 있다. 질환연구를 목적으로 제작된 동물모델은 인간을 대체하여 발병기전 규명과 더불어 병변의 진행과정 등 질환의 병태생리를 보다 깊게 연구하는데 중요하게 사용이 되고 있으며, 약물개발 과정에서도 약동학과 독성평가 및 약물 유효성평가에 필수적으로 사용이 되고 있다. 질환동물모델은 화학적, 물리적, 생물학적 방법을 통해 질환을 유발하며 제작에 사용되는 실험동물은 일반적으로 널리 사용되고 있는 설치류부터 인간과 유사성이 가장 높은 비인간 영장류에 이르기까지 제작 목적에 따라 다양하게 사용이 되고 있다.¹ 본고에서는 다양한 질환동물모델 중 폐 질환 연구를 위해 개발된 호흡기질환동물모델에 대해 소개를 하고자 한다.

1. 기도내 투여(Intratracheal instillation, ITI) 기술을 이용한 호흡기질환동물모델 제작

HIRA빅데이터개방포털 자료에 따르면 흡연, 대기중 미세먼지, 바이러스 감염 등 다양한 요인에 의해 국내 호흡기 질환관련 환자는 2021년 이후 꾸준히 증가하고 있는 추세로 호흡기질환에 대한 기전연구와 약물개발을 위한 호흡기질환동물모델의 지속적인 수요가 요구되고 있는 상황이다. 일반적으로 호흡기질환의 발병은 공기를 매개로 발생하며 흡입된 물질의 종류와 양에 따라 병변이 달라지게 되는데 호흡기질환동물모델 제작 시 동물실험의 재현성 증가와 개체간 차이를 최소화하기 위해서는 정량의 호흡기질환 유도물질을 개체별로 동일하게 흡입 전달하는 것이 중요하다.² 정확한 흡입노출을 수행하기 위해서는 다량의 시험물질, 에어로졸 발생기, 노출 챔버, 배기시설 등 다양한 시설 및 장비가 필요하여 고비용과 기술적 전문성이 요구된다는 단점이 존재하는데 이러한 문제점을 해결하기 위해 시설, 장비, 기술력, 비용 등이 비교적 적게 요구되고 흡입 가능한 물질을 폐 내로 직접적으로 전달할 수 있는 ITI 기술이 최근 많은 시험에서 사용되고 있다.^3-7 기존의 ITI 방식은 마취된 동물의 기도 부분에 외부 광원을 조사하고 투여자가 육안으로 기도내 비춰지는 광원을 보고 직접 기도내로 실린지 노즐을 삽관 후 투여를 수행하는 방식이다. 하지만 이러한 방식의 ITI 방식은 마리당 투여시간이 길고 투여자에게 고도의 전문성이 요구되며 정량의 약물이 전달되었는지에 대한 신뢰도가 다소 떨어지는 단점이 존재한다. 이러한 단점을 극복하기 위해 안전성평가연구소에서는 광원과 카메라 및 투여노즐을 사용하여 내시경 카메라와 유사한 방식으로 정량의 시험물질을 투여하는 기술을 자체 개발하였다. 이렇게 개발된 ITI 기술은 빠른 투여속도와 모니터를 통해 투여노즐이 기도에 정확히 삽관을 하였는지 여부를 실시간으로 직접 확인할 수 있으며 정량의 시험물질을 기계를 통해 투여한다는 점에서 현재 존재하는 ITI 방식 중 가장 우수한 투여 기술로 평가받고 있다. 현재 안전성평가연구소에서는 ITI 기술 개발에서 한발 더 나아가 에어로졸, dust, 점적 등 다양한 방식의 시험물질 투여 방법이 계속해서 연구되고 있다. 본고에서 기술하게 될 호흡기질환동물모델 제작에는 개체간 질환이 유도된 정도의 차이를 최소화하고 시험의 재현성을 높이기 위해 투여 신뢰도가 높은 안전성평가연구소에서 개발한 ITI 기술을 활용하였다.

그림 1. 안전성평가연구소에서 개발한 ITI 기술

2. LPS (Lipopolysaccharide) 유도 급성호흡곤란증후군(acute respiratory distress syndrome, ARDS) 마우스 모델
ARDS는 매년 300만명 이상의 환자들이 고통을 받고 증후군으로 중환자실에 입원한 중증 환자들 중 약 40%는 ARDS에 의해 사망할 정도로 치명적인 임상 증후군이다. ARDS는 임상적 증상으로는 폐포 손상과 염증 및 부종이 특징이며, 이는 산소 공급이 저하되는 급성 호흡 부전을 일으키는 상황을 초래한다.^8,9 특히 최근 환자실 치료가 필요한 코로나 19 환자들은 대부분 ARDS에 의한 호흡부전을 동반하였기 때문에¹⁰ ARDS의 모델 개발이 중요하다고 판단된다. 본 연구진은 BALB/c 마우스에 LPS (lipopolysaccharide)를 단회 ITI 투여하고 48시간 뒤 부검을 수행하는 방법으로 ARDS 마우스 모델을 제작하였는데 제작된 마우스 모델에서는 폐 중량 증가, 폐내 염증세포 및 염증성 사이토카인 증가 등 ARDS 환자에게서 관찰되는 폐내 염증 증가가 충분히 반영되었음을 확인하였다.

그림 2. LPS 유도 ARDS 마우스 모델

3. PPE (Porcine pancreatic elastase)와 LPS 복합 유도 만성 폐쇄성 폐질환(COPD; Chronic Obstructive Pulmonary Disease) 모델
COPD는 국내 70세 이상 인구의 사망원인 중 4번째를 차지하고 있으며 폐내 만성적인 기도 염증과 점액 과다분비, 기도 재형성 및 폐기종을 특징으로 폐기능 감소에 따른 호흡곤란을 초래하는 퇴행성 호흡기 질환이다.¹¹ COPD의 주요 발병 요인으로는 흡연을 비롯하여 유해가스, 세균 및 바이러스이며 만성적인 기침과 가래, 호흡곤란이 주요한 증상으로 알려져 있다.¹² COPD 환자에게서는 폐조직이 파괴되면서 폐내 공간이 생기는 폐기종이 관찰되는데 이러한 폐 손상으로 인해 발병 초기에는 빠른 걸음이나 계단을 오를 때 등의 상황에서만 일부 호흡곤란 증상이 나타날 수 있지만, 병증이 점차 진행됨에 따라 안정 시에도 호흡 곤란을 느끼게 된다. 본 연구진은 BALB/c 마우스에 day 1, 8에 PPE를 ITI 투여하고, day 5, 12에 LPS를 ITI 투여하여 day 15에 부검을 수행하는 방법으로 COPD 마우스 모델을 제작하였으며 폐 중량 증가와 폐내 만성염증성 세포 증가, 폐 기능 감소 및 폐기종 증가에 따른 조직병리학적 변화가 관찰되어 COPD환자에서 나타나는 호흡기능 저하 및 폐기종 증가라는 병태학적 특징을 확인할 수 있었다.

그림 3. PPE+LPS 유도COPD 마우스 모델

4. OVA (Ovalbumin) 유도 천식(Asthma) 마우스 모델
천식은 유전적‧환경적 요인이 복합적으로 작용해 발생하는 질환으로 만성적 기관지 염증, 점액 과다형성, 기관지 과민반응을 특징으로 한다.¹³ 천식은 일반적으로 대기오염물질을 비롯하여 꽃가루, 바퀴벌레, 집먼지 진드기, 곰팡이 등의 흡입에 의해 발생하며, 면역체계가 흡입된 알레르기성 외부 물질에 의해 Th2 면역반응이 유발되어 발생한다.¹⁴ 본 연구진은 BALB/c 마우스에 day 1, 8에 OVA를 복강투여하여 감작을 하였으며 day 15, 16, 17에 OVA를 ITI 투여하여 챌린지 과정을 거쳐 day 19에 부검을 수행하는 모델을 제작하였다. 본 모델에서는 폐 중량 증가와 폐내 호산구 증가, Th2 면역반응의 사이토카인인 IL-4, IL-5, IL-16의 증가, 폐내 염증세포 증가 및 기관지 상피의 점액 세포 과형성이 관찰되었는데 천식 환자에게서 관찰되는 폐내 변화가 잘 반영되었음을 확인할 수 있었다.

그림 4. OVA 유도 천식 마우스 모델

5. BLM (Bleomycin) 또는 PHMG (Polyhexamethylene guanidine) 유도 폐 섬유화증 마우스 모델
폐 섬유화증은 폐내 섬유화와 염증반응 및 구조적 변화를 동반하는 만성적인 폐 질환으로 발병 원인으로는 독성물질과 자가면역반응, 감염 및 직접적인 손상 등이 있다.¹⁵ 폐 섬유화증은 손상된 폐포가 치유되는 과정에서 염증반응에 의해 섬유아세포(fibroblast)와 근섬유모세포(myofibroblast)의 증식이 촉진되며 세포외기질(ECM, Extracellular matrix)에 과도한 콜라겐이나 기타 단백질의 축적에 의해 발생하는 것으로 알려져 있다.^16,17 본 연구진은 C57BL/6 마우스에 day 1 BLM 또는 PHMG를 기도내 투여하여 day 22 부검을 수행하여 폐 섬유화증 마우스 모델을 제작하였으며 폐 중량 증가와 더불어 폐 섬유화증 환자의 특징인 폐내 섬유화 또한 본 모델에서도 동일하게 관찰됨을 확인할 수 있었다.

그림 5. BLM 유도 폐 섬유화증 마우스 모델

맺음말
호흡기질환동물모델은 인간의 호흡기질환에 대한 병태생리를 이해하고 효과적인 치료제를 개발하는데 중요한 역할을 하고 있다. 하지만 흡입치료제 개발에는 단순히 인간의 호흡기질환을 모사하는 수준을 넘어 약물의 작용방식(mode of action, MoA)이 고려된 유효성평가에 적절한 동물모델이 필요하다. 본 연구진은 인간의 호흡기질환을 정확하게 모사하고 인간의 면역 시스템과 조직을 보다 정교하게 재현할 수 있도록 다양한 호흡기질환동물모델 개발 연구를 수행하고 있으며 치료 후보 물질의 MoA를 고려한 호흡기질환동물모델 개발 연구도 함께 수행하고 있다. 더 나아가 치료제 개발을 하고자하는 연구진들과의 호흡기질환동물모델을 활용한 공동연구를 통해 더욱 안전하고 효과적인 치료제 개발을 기대하고 있다.

참고문헌

1. 이제욱. (2020). 인간의 질병을 가진 동물 모델. BRIC View 동향리포트, BRIC View 2020-T31.

2. Oberdorster, G. (1996). Significance of particle parameters in the evaluation of exposure-dose-response relationships of inhaled particles. Inhalation toxicology, 8(Suppl), 73-89.

3. Kim, H. Y., Kim, K., Kim, I. H., Kim, M. S., Kim, S. H., & Lee, K. (2019). Acute Toxicity Study of the Glyoxal by Intratracheal Instillation in Male Sprague-Dawley Rats. Journal of Korean Society of Occupational and Environmental Hygiene, 29(4), 508-516.

4. Kim, M. S., Kim, S. H., Jeon, D., Kim, H. Y., & Lee, K. (2018). Changes in expression of cytokines in polyhexamethylene guanidine-induced lung fibrosis in mice: Comparison of bleomycin-induced lung fibrosis. Toxicology, 393, 185-192.

5. Kim, M. S., Kim, S. H., Jeon, D., Kim, H. Y., Han, J. Y., Kim, B., & Lee, K. (2018). Low-dose cadmium exposure exacerbates polyhexamethylene guanidine-induced lung fibrosis in mice. Journal of Toxicology and Environmental Health, Part A, 81(11), 384-396.

6. Kim, H. Y., Kim, M. S., Kim, S. H., Joen, D., & Lee, K. (2018). Protective effects of nintedanib against polyhexamethylene guanidine phosphate-induced lung fibrosis in mice. Molecules, 23(8), 1974.

7. Kim, M. S., Han, J. Y., Kim, S. H., Jeon, D., Kim, H. Y., Lee, S. W., ... & Lee, K. (2018). Oleanolic acid acetate attenuates polyhexamethylene guanidine phosphate-induced pulmonary inflammation and fibrosis in mice. Respiratory Physiology & Neurobiology, 252, 1-9.

8. Battaglini, D., Fazzini, B., Silva, P. L., Cruz, F. F., Ball, L., Robba, C., ... & Pelosi, P. (2023). Challenges in ARDS definition, management, and identification of effective personalized therapies. Journal of Clinical Medicine, 12(4), 1381.

9. 이상민, & 유철규. (2005). 급성호흡곤란증후군. 대한내과학회지, 68(5), 476-486.

10. Wu C, Chen X, Cai Y, et al. (2020). Risk factors associated with acute respiratory distress syndrome and death in patients with coronavirus disease 2019 pneumonia in Wuhan, China. JAMA Internal Medicine, 180, 934-943.

11. Ghorani, V., Boskabady, M. H., Khazdair, M. R., & Kianmeher, M. (2017). Experimental animal models for COPD: a methodological review. Tobacco induced diseases, 15, 1-13.

12. 조경숙. (2021). 우리나라 만성폐쇄성폐질환의 유병 및 관리 현황. 주간 건강과 질병, 14(16), 943-951.

13. 오재원. (2021). Korean Guideline for Asthma 2021, 대한천식알레르기학회, 2021.

14. Debeuf, N., Haspeslagh, E., van Helden, M., Hammad, H., & Lambrecht, B. N. (2016). Mouse models of asthma. Current protocols in mouse biology, 6(2), 169-184.

15. Glass, D. S., Grossfeld, D., Renna, H. A., Agarwala, P., Spiegler, P., DeLeon, J., & Reiss, A. B. (2022). Idiopathic pulmonary fibrosis: Current and future treatment. The clinical respiratory journal, 16(2), 84-96.

16. Moss, B. J., Ryter, S. W., & Rosas, I. O. (2022). Pathogenic mechanisms underlying idiopathic pulmonary fibrosis. Annual Review of Pathology: Mechanisms of Disease, 17(1), 515-546.

17. Thannickal, V. J., Toews, G. B., White, E. S., Lynch Iii, J. P., & Martinez, F. J. (2004). Mechanisms of pulmonary fibrosis. Annu. Rev. Med., 55(1), 395-417.