서울대학교 시스템화학생물학 실험실

Systems Chemical Biology Lab

구성원

교수: 이현우 (rheehw@snu.ac.kr, https://sites.google.com/view/rheelab-at-snu )

Post-doc: 강명균

석박사통합과정: 곽철환, 최창렬, 박이삭, 이희용, 이윤빈, 유창모, 박철훈, 강지웅, 윤창한, 조영준, 한태영, Pratyush Kumar Mishra, Nirmali Sharma

석사과정: 박준상, 정인영

연구실 개요

본 연구실은 서울대학교 화학부 이현우 교수가 이끄는 팀으로 여러가지 화학적 단백질 표지 기술을 이용하여 세포 내 분자생물학적 현상을 밝히는 화학생물학에 근거한 실험을 수행하고 있다. 따라서 본 연구실에서는 유기합성부터 시작하여 다양한 생화학적 실험을 수행하고 있으며 구성원들이 한 분야에 치우치지 않고 여러 경험을 통해 유연한 사고방식으로 과학적인 현상에 접근할 수 있도록 지원하고 있다.

본 연구실에서 진행중인 연구 프로젝트로는 살아있는 세포에서 특정 단백질의 세포 내 위치 및 상호작용 단백질 (in vivo interactome)을 밝혀낼 수 있는 효소화학반응을 이용한 (1) 새로운 근접분자 표지기술 (proximity labeling) 및 분석 방법의 개발과 (2) 이 방법을 이용하여 미토콘드리아 및 다양한 세포소기관 내의 세부 단백질체 지도 구축을 목표로 연구하고 있다. 또한 이 기술을 응용하여 (3) 세포소기관들의 막 접촉점 (membrane contact site)에서 작용하는 단백질 동정 및 기능 규명에 관한 연구도 진행중이며 (4) 또한 기존의 proximity labeling의 힌계점들을 보완할 수 있는 새로운 근접분자 가교 (proximity crosslinking) 기술의 개발도 진행하고 있다. 이러한 기술들은 박테리아, 효모, 동물세포 등 여러 세포에서 사용될 수 있으며 생명체에서도 응용할 수 있다. 본 연구실은 미토콘드리아와 대사생물학과 관련된 많은 연구주제들에 관심을 두고 있으며, 현재 진행 중인 프로젝트들은 다음과 같다.

연구 내용

1. APEX와 BioID/TurboID에 의해 바이오틴화된 펩타이드 분석법 (Spot-ID) 개발

인간 세포 내에는 약 2만개의 단백질이 있다고 알려져 있으며, 대부분의 단백질은 특정한 공간에서 다른 단백질과 복합체를 이루거나 다른 단백질로부터 신호를 받아 세포 내 중요한 역할을 담당하고 있다. 지금까지 이 상호작용들을 밝히기 위한 막대한 노력에도 불구하고 기존의 면역침강법 (Co-IP) 기술이 갖는 세포 용해 (lysis) 과정이후에 단백질을 분리과정에서 오는 세포용해버퍼 (cell lysis buffer) 상에서의 인공적인 단백질 결합정보의 한계점과 광학현미경의 resolution의 한계로 인해 정확한 세포내 단백질 위치 지도는 아직까지 완성되지 못했다. 이런 한계점을 보완하기 위해 근접분자 표지기술 (proximity labeling)이 최근에 개발이 되었고, 이 기술은 반경 20-50 nm 이내의 단백질들을 무작위적으로 biotin (바이오틴)기를 달 수 있는 APEX나 BioID/TurboID 등의 효소 화학 반응에 기반한다. 특별히 APEX는 peroxidase 효소 (28 kDa)로서 살아있는 세포에 특정 단백질 (protein of interest, POI) 과 유전결합하여 발현시키면 POI 단백질의 주변 단백질의 타이로신 잔기에 바이오틴화 시킬 수 있다.

이때 APEX에 의해 바이오틴화된 단백질을 스트렙타비딘 (Streptavidin) 비드로 분리하여 질량분석으로 정확히 검출하는 것이 가장 중요한 과정이라고 볼수 있는데, 많은 연구자들이 스트렙타비딘 비드로 분리한 단백질들에서 바이오틴화 되지 않은 펩타이드를 질량분석하는 간접적인 분석 방법을 택하고 있으나 이 방법을 따르면 스트렙타비딘 비드 표면에 붙은 단백질 그리고 바이오틴화된 단백질에 lysis과정중에 강하게 붙은 바이오틴화되지 않은 단백질들도 모두 검출될수 있기 때문에 이 방법을 따르게 되면 APEX로 레이블링된 단백질에 대한 정보를 정확히 검출하지 못하는 한계점에 다다르게 된다.

이에 본 연구실은 단백질에서 바이오틴화된 펩타이드를 질량분석할 수 있는 기술인 Spot-ID 기술 (그림 1)을 개발하였고 이를 이용해 APEX가 레이블링하는 주변 단백질체의 정보를 가장 정확하게 분석할 수 있음을 확인하였다. 더 나아가 본 연구실은 APEX 레이블링에 프로브로 사용되는 바이오틴-페놀 (biotin-phenol)의 황 (sulfur) 원자가 레이블링 반응중에 산화됨을 알게 되었고 이를 방지하고자 황 원자가 없는 데스싸이오바이오틴-페놀 (desthiobiotin-phenol, DBP) 프로브를 새롭게 개발하였다. 이 새로운 프로브는 미토콘드리아의 세부 단백질체를 규명하는데 사용되었으며 현재에도 마우스 모델에 발현한 APEX 레이블링에도 성공적으로 사용되고 있다. 

3. 세포소기관 간의 막 접촉점 단백질체의 연구

세포 내 다양한 세포소기관들도 서로 소통 (communication)을 하면서 여러 중요한 기능을 조절하는데, 미토콘드리아와 소포체가 막접촉점 (membrane contact site)를 통해 소통하는 것은 이미 잘 알려져 있으며 MAM (mitochondrial associated membrane)이라는 막접촉점을 통해서 칼슘의 이동, 지질대사, 세포예정사멸 등 다양한 기능이 조절된다는 것이 세포생물학자들에 의해 활발히 연구되어오고 있다. 본 연구실은 스플릿 BioID 시스템에서 출발하여 각 fragment를 를 미토콘드리아와 소포체에 발현시켜 두 소기관이 접촉하는 MAM에 존재하는 단백질만을 선택적으로 바이오틴화 시키는 방법인 Contact-ID 기술을 개발하였다 (그림 3). 이를 이용해 Hek293T 세포에서 115개의 미토콘드리아와 소포체의 막접촉점인 MAM에서 기능하는 단백질들을 찾아내었으며 동정된 단백질 중에서도 FKBP8이라는 단백질이 미토콘드리아와 소포체가 연결된 구조 (mitochondria associated membrane; MAM)의 형성에 매우 중요하며 소포체-미토콘드리아 칼슘의 수송에 중요한 역할을 하는 것을 밝혀내었다. 향후 본 연구실에서 세포소기관 간의 막접촉점에 관한 연구는 질병과의 상관성에 집중하여 SARS-CoV-2의 replication에 영향을 미치는 MAM 단백질 동정 및 알츠하이머병 발병에 관여하는 MAM 단백질의 기능을 연구하는 방향으로 확장해나가고자 한다.

                             그림3. 미토콘드리아-소포체 막접촉점에서 활성을 갖는 proximity labeling 효소인 Contact-ID를 이용해
                                     MAM 단백질을 바이오틴화 하는 과정에 대한 모식도 (위) 및 질량분석 결과 (아래 왼쪽).
                                     MAM 단백질인 FKBP8이 미토콘드리아-소포체 칼슘 transport에 미치는 영향에 관한 모식도

4. 단백질 상호작용체 연구를 위한 광학가교결합 기술 개발

현재의 APEX나 BioID/TurboID를 사용한 근접분자 표지기술은 살아있는 세포의 local proteome을 알아내는 데에는 굉장히 유용한 기술이나 표지 반경이 20-50 nm 이기 때문에 단백질의 결합 파트너 (protein-protein interaction partner)를 찾는데에 가장 효율적인 기술이라고 이야기하기는 어렵다. 이에 본 연구실에서는 기존의 근접분자표지 기술의 한계점을 뛰어넘을 수 있는 광가교결합 (photo-crosslinking)에 기반한 proximity crosslinking 기술을 개발중에 있다. 이 방법을 이용하게 되면 광가교결합을 일으킬 수 있는 화학물질을 세포 내 특정 위치 및 특정 단백질 (POI)에 표적화시킬 수 있으며 특정 파장대의 빛을 쬐어주면 POI 단백질과 주변의 단백질과 공유결합을 선택적으로 유도할 수 있다. 그 뒤에 크로스링킹된 단백질들을 분리해서 질량분석을 통해 상호작용 단백질을 알아낼 수 있으며 본 연구실에서는 광독성이 적은 가시광선을 이용한 광학가교법을 개발하고 있기 때문에 이 기술 또한 동물 모델에서도 사용할 수 있을 것으로 보인다.

전망 (Outlook)

현재 많은 연구자들이 proximity labeling (PL) 기술을 살아있는 세포 (cultural cell)에서 주로 적용하고 있으나 본 연구실을 포함하여 전세계의 몇몇 연구실이 proximity labeling을 수행할 수 있는 유전자 형질전환 마우스 모델 (transgenic mice model)을 구축하여 생리적인 조건에서 조직특이적인 세포소기관 단백질체 및 interactome을 정보를 얻는 연구를 수행 중에 있다. PL 방법을 실험동물에 적용하여 얻은 결과는 기존의 실험 방법으로는 볼 수 없는 굉장히 새롭고 중요한 단백질 정보를 전달해 줄 수 있기 때문에 실험동물에 적용하여 진행하는 PL 연구의 중요성은 앞으로도 더 부각될 것으로 보인다.

최근 주요논문 성과

1. Lee SY, Kang MG, Park JS, Lee G, Ting AY*, Rhee HW* APEX fingerprinting reveals the subcellular localization of proteins of interest. Cell Rep, 2016, 15, 1837-1847.

2. Park JS, Nam E, Lee HK, Lim MH*, Rhee HW* In Cellulo Mapping of Subcellular Localized Bilirubin. ACS Chem. Biol. 2016, 11, 2177-2185.

3. Lee SY†, Lee H†, Lee HK, Lee SW, Ha SC, Kwon T, Seo JK*, Lee C*, Rhee HW* Proximity-Directed Labeling Reveals a New Rapamycin-Induced Heterodimer of FKBP25 and FRB in Live Cells. ACS Cent. Sci. 2016, 2, 506-516. (†equally contributed).

4. Kang MG, Park J, Balboni G, Lim MH, Lee C, Rhee HW* Genetically Encodable Bacterial Flavin Transferase for Fluorogenic Protein Modification in Mammalian Cells. ACS Synth. Biol. 2017, 6, 667-677.

5. Lee SY, Kang MG, Shin S, Kwak C, Kwon T, Seo JK*, Kim JS*, Rhee HW*, Architecture Mapping of the Inner Mitochondrial Membrane Proteome by Cheimcal Tools in Live Cells. J. Am. Chem. Soc. 2017, 139, 3651-3662.

6. Kang MG†, Lee H†, Kim BH, Dunbayev Y, Seo JK, Lee C*, Rhee HW*, Structure-Guided Synthesis of a Protein-Based Fluorescent Sensor for Alkyl Halides, Chem. Commun. 2017, 53, 9226-9229. (†equally contributed).
7. Kwak C†, Shin S†, Park JS†, Jung M, Nhung TTM, Kang MG, Lee C, Kwon TH, Park SK*, Mun JY*, Kim JS*, Rhee HW* Contact-ID, a tool for profiling organelle contact site, reveals regulatory proteins of mitochondrial-associated membrane formation, PNAS, 2020, 117, 12109-12120 (†equally contributed).