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한국실험동물학회 뉴스레터	2023년 9월
[질환모델동물] 면역관문저해제의 비임상 항암평가를 위한 인간화마우스 개발 동향

면역관문저해제의 비임상 항암평가를 위한 인간화마우스 개발 동향 지에이치바이오(주) 박인선, 유경원, 유대열(dyyu@gh-bio.com) 1. 면역관문저해제 개발 동향 일반적으로 암세포는 T세포의 면역 공격을 회피하기 위해 종양 미세 환경을 변화시키는데, 이때 면역 관문 (immune checkpoint) 기능을 이용한다. 면역관문저해제 (immune checkpoint inhibitor)는 암 면역 요법의 한 형태로 T 세포 같은 일부 면역세포 및 암세포에서 발현되는 면역관문이라고 하는 단백질을 차단하는 약물 유형이다. 면역관문의 주된 기능은 면역반응이 너무 강해져 염증반응 등을 방지하는 것이지만 때로는 T세포의 활성을 억제시켜 면역반응에 의한 암세포 공격을 막기도 한다. 이러한 면역관문을 차단하면 면역계 기능을 회복시킬 수 있어 암치료에 사용되기도 한다 [wikipedia.org]. 2020년까지 FDA (Food and Drug Administration)와 EMA (European Medicines Agency)를 통해 허가된 면역관문저해제는 8제품으로, PD1/PDL1저해제가 7제품 그리고 CTLA저해제가 1제품 있는 것으로 보고되었다. 이어 93건의 면역관문저해제의 암 적응증이 허가되어 있고, 이중 CTLA4/PD-1 병용치료 건수가 12건이나 된다 (http://dx.doi.org/10.1136/jitc-2022-SITC2022.0427). CTLA-4와 PD-1/PD-L1 저해제의 성공에도 불구하고, 면역항암제 단독요법은 10-30%의 일부 환자들에게 치료효과가 있고 나머지 환자들에게는 반응이 없거나 미미하여, 면역항암제의 치료효과를 향상시키는 연구개발이 절실한 상태이다. 따라서 면역관문저해제 끼리, 또는 화학항암제, 표적항암제, 및 방사선요법과의 병용투여 또는 병용요법을 통해 항암효과를 증진시키는 연구가 활발히 진행되고 있다. 2. 면역관문저해제 항암평가를 위한 인간화마우스 모델 인간의 종양 미세환경의 복잡성을 보다 정확히 재현하는데 인간의 면역시스템을 지닌 동물모델이 필요하고, 면역관문저해제 같은 면역치료제의 출현으로 동물모델의 사용은 점점 복잡해지고 있어, 임상반응을 예측하는데 동물모델의 활용은 더욱 신중하게 되었다. 대부분의 전임상 약물 유효성 평가는 면역부전마우스에 인간 종양세포가 이종이식된 동물 모델에서 수행되어 왔는데, 이 모델은 면역이 부전된 마우스를 사용함으로 면역세포를 타겟하는 면역항암제의 유효성 평가가 불가능하다. 때문에 인간 기능성 혈액세포 또는 줄기세포 (PBMC or CD34+)를 면역부전마우스에 이식한 면역인간화마우스가 개발되었다. 이 모델은 인간 종양세포 이종이식 및 인간 면역세포 환경에서 인간 면역항암제 유효성 평가가 가능하나 매번 면역부전마우스에 혈액세포 또는 줄기세포를 이식해야 하므로 평가하는데 오랜 기간이 걸리고 비용이 훨씬 많이 소요된다. 또한 낮은 수준의 골수 계통의 면역세포 및 불완전한 세포 발달 및 분화 등의 단점이 있다. 따라서 인간 유전자로 치환한 녹인 (Knock-In) 인간화마우스를 사용하는 것이 실험기간도 짧고 더 경제적이며 정상 면역체계를 갖기 때문에 인간항체치료제의 항암효능평가에 더 적합한 모델이다. 오늘날 임상에서 널리 사용되고 있는 항암기능이 탁월한 항체는 인간화항체이다. 면역항암제로 잘 알려진 인간 면역관문저해제 (인간 PD1 항체 등)의 개발을 위해서는 기존의 syngeneic 마우스 모델로는 효능 평가가 불가하며, 인간 면역관문유전자를 지닌 인간화마우스가 필요하다. 왜냐하면 면역관문단백질은 종간에 구조적인 차이가 있어 종양형성 중 PD1항체를 처리해도 PD1/PD-L1 axis와 같은 면역회피가 활성화되어 PD1인간화항체는 마우스에서 작동하지 않음이 밝혀져 있고 (Rangarajan 등, 2003), 본 연구팀에서도 아래와 같이 동일한 결과를 확인하였다. 즉, syngeneic 대장암 마우스 모델에서 PD1항체인 키투르다와 옵디보 등을 처리한 결과, 대조군과 동일하게 키투르다의 항암기능이 전혀 확인되지 않았다 (그림 1). 한편 본 연구팀이 개발한 PD1 유전자 인간화마우스에 MC38세포주를 이식하여 종양을 유도하고 키투르다 등의 3종의 면역항암제를 투여한 결과, 면역항암제 투여 실험군에서 유의성 있게 종양형성이 억제되는 것을 확인하였고 (그림 2), 이 결과를 통해 본 연구팀이 개발한 PD1 유전자 인간화마우스가 PD1후보항체의 효능평가에 아주 유용한 동물모델임을 확인해 주었다. < 그림 1. Syngeneic model에서 PD1면역항암제의 효능 평가 결과 > 3. 면역관문저해제 병용치료를 위한 마우스 모델 최근 면역관문저해제는 다양한 암환자의 치료효과를 획기적으로 증진시켜 암생물학의 치료 패러다임을 바꾸어 주었으며, 특히 면역관문저해제의 병용치료는 면역치료의 임상적 유용성을 넓혀줄 것으로 기대되고 있다 (Patel 등, 2018). 따라서 면역관문저해제의 병용투여에 의한 항암효능을 비임상모델에서 평가하기 위한 최적의 마우스가 필요하다. 병용치료를 위한 항암효능평가를 위해 LAG3, TIM3, 및 TIGIT 유전자 인간화마우스가 PD1유전자 인간화마우스와 더불어 중요한 마우스이다. 왜냐하면, LAG3, TIM3, 및 TIGIT은 자극을 받은 T 세포에 과발현되어 있고 T세포의 과잉 활성을 막는 면역관문단백질로 미래의 첨단면역항암요법 타겟으로 주목을 받고 있기 때문이다 (Anderson 등, 2016). 특히 이들은 PD1인간항체의 치료 후 발현이 증가됨으로 이들 각각의 저해제는 PD1항체와의 병용투여로 항암효과를 유의성 있게 증진시키는 것으로 알려져 있다. < 그림 2. PD1 유전자 인간화마우스에 3종의 PD1 면역항암제의 효능 평가 결과 > 이에 세계적인 실험동물전문기업을 중심으로 TIM3, TIGIT, LAG3 유전자 인간화마우스 및 PD1유전자 인간화마우스와의 이중, 삼중 인간화마우스가 만들어져 면역관문저해제의 항암효능평가에 활용되고 있으며, 본 연구팀도 TIM3와 TIGIT 유전자의 인간화마우스를 각각 제작하였다. 또한 면역관문저해제 끼리의 병용치료모델로 PD1/TIM3 및 PD1/TIGIT 유전자 인간화마우스를 제작하여 면역항암제의 항암효능평가시스템을 구축 중이다. 고로 본 지면에서는 TIM3, TIGIT, LAG3 유전자 인간화마우스의 최신 지견을 소개하고자 한다. 1) TIM3 유전자 인간화마우스 T cell immunoglobulin and mucin domain-containing protein 3 (TIM3)는 정상적인 면역반응을 조절하는 면역관문인자지만 암세포가 면역감시를 회피하는데 이용될 수 있고, 주로 기능이 소실된 T세포에서 발현되고, 그 리간드에 결합하여 TIM3 매개된 T 세포 저해를 촉진하는 것으로 알려져 있다 (Zhang 등, 2020). 인간 TIM3항체는 T세포 저해를 파기하고 항원 특이적 T세포를 활성화시켜 항암 면역을 증진시키는 것으로 보고되었다 (Zhang 등, 2020). 따라서, TIM3 유전자 인간화마우스 개발은 항암효능평가에 유용한 모델로 할용 될 수 있을 것으로 판단된다. TIM3유전자 인간화마우스는 세계적인 실험동물전문기업들에서 개발하여 제공하고 있는데, 일반적으로 면역글로블린 유사 V-타입 도메인을 인코드하는 마우스 Tim3 유전자의 엑손 2를 인간 Tim3 엑손 2로 치환시킨 녹인 (knock-in)마우스이다. Kuang 등 (2020)은 TIM3 인간화항체 (IBI104)가 인간화 TIM3에 효율적으로 결합할 수 있고 마우스 TIM3에는 결합하지 않는 것을 확인하고, MC38종양세포를 이식한 TIM3유전자 인간화마우스에서 이 항체의 항암효능을 평가하였다. 그 결과, IBI104 단독투여로는 항암효능이 확인되지 않았고, PD1인간항체를 단독 처리한 경우, 50% 종양 성장이 줄어들었지만, TIM3 인간화항체와 PD1인간항체를 병용투여 하였을 때 항암효능이 PD1인간항체만 처리한 경우보다 유의성 있게 증가된 것을 보고함으로 TIM3 인간화항체가 PD1인간항체와의 병용치료에 활용될 수 있을 것으로 제안 되고 있다. 따라서 TIM3 유전자 인간화마우스가 TIM3인간항체와 다른 면역관문저해제와의 병용투여에 따른 항암효능평가에 유용한 마우스 모델로 판단된다. 2) TIGIT 유전자 인간화마우스 T cell immunoglobulin and ITIM domain (TIGIT)은 NK 세포와 T세포에 의해 발현되는 CD28 패밀리 유사 수용체의 일부로 이들 세포에 대한 직접적인 면역억제 효과를 발휘하고, IL-10같은 면역조절 사이토카인의 방출을 간접적으로 증가시키며, INF-gamma 와 IL-17의 생산을 감소시키고, 또한 수지상세포 (Dendritic Cells ; DCs)의 성숙을 저해하는 기능이 밝혀졌다 (Hung 등, 2018). TIGIT과 PD1을 저해하면 종양항원 (Tumor Antigen : TA) 특이적 CD8+ T 세포와 종양침투백혈구 (Tumor infiltrating lymphocytes : TIL) CD8+ T 세포의 세포증식, 사이토카인 생산 및 탈과립을 증진시켜 (Chauvin 등, 2015), 마우스 실험에서 종양 억제를 유도하는 것으로 알려져 있다 (Johnston 등, 2014). 최근 TIGIT은 면역관문 (immune checkpoint)으로 확인되었으며, TIGIT 저해제는 진행형 고형암 환자의 단독치료 또는 PD-1/PD-L1 항체와의 병용치료로 임상시험 중에 있다 (Harjunpaa 등, 2020). 이처럼 TIGIT 저해제는 단독 또는 병용치료 항암치료 효과가 보고되고 있으며, 미국 등 선진국을 포함한 우리나라 기업에서 다양한 TIGIT저해제를 개발하고 있고, 이들 항체에 대한 비임상 항암실험이 요구되고 있어, TIGIT 유전자 인간화마우스 개발은 항암효능평가에 유용한 모델로 활용될 것으로 판단된다. Ju 등 (2020)은 마우스 TIGIT의 세포외 도메인이 사람 세포외 도메인으로 치환된 TIGIT유전자 인간화마우스를 만들고 마우스 대장암세포 MC38 또는 CT26 세포를 이식한 BALB/c 또는 C57BL/6마우스에 TIGIT인간항체를 처리한 결과, CT26 세포를 이식한 TIGIT유전자 인간화 BALB/c 마우스에서 항암효능이 강하게 관찰되었으나 MC38세포를 이식한 TIGIT유전자 인간화 C57BL/6 마우스에서는 항암효능이 확인되지 않았다. 그 결과를 조사한 결과, CT26 세포를 이식한 TIGIT유전자 인간화 BALB/c 마우스의 종양 내 NK세포와 T-reg세포 수준이 유의성 높게 증가 되어 있음을 알 수 있었고, 더 흥미로운 것은 TIGIT인간항체를 처리한 다음, T-reg세포가 완전히 소실되었다는 점이다. 따라서 TIGIT유전자 인간화 BALB/c 마우스는 TIGIT인간항체의 항암효능평가에 유용한 마우스인 것으로 확인되었다. Liu 등 (2021)은 PD-1/PD-L1/TIGIT 유전자 삼중 인간화마우스를 제작하고 MC38-hPD-L1종양 모델에서 PD-L1과 TIGIT의 인간항체 병용투여 했을 때 유의성 있는 항암효과를 볼 수 있었다. 3) LAG3 유전자 인간화마우스 lymphocyte-activation gene 3 (LAG-3)는 CD223으로도 알려져 있으며 활성화된 helper T세포와 cytotoxic T세포, regulatory T세포, 일부NK세포, B세포 등에서 발현된다. 주요 리간드는 MHC-II (Major histocompatibility complex ; 주요조직적합성 복합체)이다. PD-1과 마찬가지로 T세포의 활성화와 사이토카인을 억제하는 역할을 하며, 암세포가 분화할 때 면역 감시를 피하기 위해 LAG-3 경로를 이용한다. 따라서 LAG-3를 저해하면 면역세포가 활성화되고 암세포의 성장이 억제될 것으로 예상하며, 특히 PD-1 내성을 지연시키거나 극복할 수 있을 것으로 기대되어 Lag3 저해제의 개발에 유명 제약사들이 참여하고 있다. Burova 등 (2019)은 마우스 세포외 도메인이 사람 세포외 도메인으로 치환된 PD-1/LAG3 유전자 이중 인간화마우스를 제작하고, 이들 마우스 종양모델에서 PD1인간항체와 LAG3인간항체의 병용투여에 의한 항암효능을 평가한 결과를 보고한 바 있고, Li 등 (2021)도 LAG-3인간항체의 항암효능평가를 위해 LAG-3 유전자 인간화마우스를 생산하였는데, 그들은 세포외 도메인을 인코드하는 마우스 LAG-3 유전자의 엑손 2-7이 인간 LAG-3 엑손 2-7으로 치환하는 방식으로 제작하고, LAG-3인간항체의 항암효능을 평가한 결과를 보고하였고, 또한 PD-1/PD-L1/LAG3 유전자 삼중 인간화마우스를 제작하고 MC38종양모델에서 LAG-3인간항체가 PD1인간항체와 병용 투여하였을 때 시너지 항암효과를 볼 수 있었다고 보고하였다. 4. 맺는말 2011년 CTLA4 항체가 전이성 흑색종의 치료를 위해 허가받은 이래, 면역관문인자는 암치료타겟으로 암연구의 대세를 이루고 있으며, PD1 및 CTLA4 항체 이외의 효능이 탁월한 면역관문저해제를 찾기 위한 연구가 지속적으로 이루어져, 상기 언급한 TIM3, TIGIT, LAG3 등 인간 항체가 개발되어 비임상 또는 임상시험 중에 있다. 하지만 차세대 항암제로 각광을 받은 면역관문저해제도 항암효능이 일부 환자에 국한되어 있고 저해제의 투여에 따른 내성이 생겨, 이러한 문제점을 극복하기 위한 연구가 절실한 상태이다. 최근 암치료에는 병용요법이 단독요법보다 탁월한 효능을 보이고 있어 면역항암제와의 병용치료가 대세이며, 병용투여에 따른 항암효능을 평가하기 위한 인간화마우스의 개발 및 활용이 중요하게 되었다. 상기 언급한 3종의 면역관문유전자 인간화마우스 및 PD1유전자 인간화마우스와의 이중, 3중 인간화마우스는 병용요법의 비임상 효능평가에 유용하게 활용되어 암환자들에게 좀 더 희망을 주는 치료법이 제공되길 기대한다. 5. 참고문헌 [1] Anderson AC, et al., Lag-3, Tim-3, and TIGIT co-inhibitory receptors with specialized functions in immune regulation. Immunity. 2016 May 17; 44(5): 989–1004. [2] Burova Elena et al. Preclinical Development of the Anti-LAG-3 Antibody REGN3767: Characterization and Activity in Combination with the Anti-PD-1 Antibody Cemiplimab in Human PD-1 x LAG-3-Knockin Mice. Mol Cancer Ther. 2019 Nov;18(11):2051-2062. [3] Chauvin JM et al.. TIGIT and PD-1 impair tumor antigen–specific CD8⁺ T cells in melanoma patients J Clin Invest.2015, 125 (5): 2046–2058. [4] Harjunpaa H and Guillerey. TIGIT as an emerging immune checkpoint. Clin Exp Immunol 2020, 200(2):108-119 [5] Hung AL et al.. TIGIT and PD-1 dual checkpoint blockade enhances antitumor immunity and survival in GBM Oncoimmunology. 2018; 7(8): e1466769 [6] Johnston RJ et al.. The Immunoreceptor TIGIT Regulates Antitumor and Antiviral CD8⁺ T Cell Effector Function Cancer Cell. 2014, 26 (6): 923–937) [7] Ju Cunxiang et al.. TIGIT humanized BALB/c mouse: A novel animal model for preclinical studies of human TIGIT antibodies. Cancer Res (2020) 80 (16_Supplement): 3256 [8] Li et al., Improved LAG-3 humanized knock-in mouse model for assessment of mono- and combination therapy strategies for cancer treatment. Cancer Res (2021) 81 (13_Supplement): 2942. [9] Kuang Z et al., A novel antibody targeting TIM-3 resulting in receptor internalization for cancer immunotherapy. Antib Ther. 2020 Dec; 3(4): 227–236. [10] Liu Chonghui et al. A novel humanized B-hPD-1/hPD-L1/hTIGIT mouse model reveals enhanced efficacy of combined TIGIT and PD-L1 blockade against cancer. Cancer Res (2021) 81 (13_Supplement): 493. [11] Rangarajan A & Weinberg RA. Nat. Rev. Cancer 2003, 3, 952–959 [12] Patel SA, Minn AJ. Combination Cancer Therapy with Immune Checkpoint Blockade: Mechanisms and Strategies. Immunity, 2018, 48(3): 417-433 [13] Zhang D et al., Identification and characterization of M6903, an antagonistic anti–TIM-3 monoclonal antibody. Oncoimmunology 2020,9(1), 1744921

면역관문저해제의 비임상 항암평가를 위한 인간화마우스 개발 동향

지에이치바이오(주)

박인선, 유경원, 유대열(dyyu@gh-bio.com)

1. 면역관문저해제 개발 동향

일반적으로 암세포는 T세포의 면역 공격을 회피하기 위해 종양 미세 환경을 변화시키는데, 이때 면역 관문 (immune checkpoint) 기능을 이용한다. 면역관문저해제 (immune checkpoint inhibitor)는 암 면역 요법의 한 형태로 T 세포 같은 일부 면역세포 및 암세포에서 발현되는 면역관문이라고 하는 단백질을 차단하는 약물 유형이다. 면역관문의 주된 기능은 면역반응이 너무 강해져 염증반응 등을 방지하는 것이지만 때로는 T세포의 활성을 억제시켜 면역반응에 의한 암세포 공격을 막기도 한다. 이러한 면역관문을 차단하면 면역계 기능을 회복시킬 수 있어 암치료에 사용되기도 한다 [wikipedia.org]. 2020년까지 FDA (Food and Drug Administration)와 EMA (European Medicines Agency)를 통해 허가된 면역관문저해제는 8제품으로, PD1/PDL1저해제가 7제품 그리고 CTLA저해제가 1제품 있는 것으로 보고되었다. 이어 93건의 면역관문저해제의 암 적응증이 허가되어 있고, 이중 CTLA4/PD-1 병용치료 건수가 12건이나 된다 (http://dx.doi.org/10.1136/jitc-2022-SITC2022.0427). CTLA-4와 PD-1/PD-L1 저해제의 성공에도 불구하고, 면역항암제 단독요법은 10-30%의 일부 환자들에게 치료효과가 있고 나머지 환자들에게는 반응이 없거나 미미하여, 면역항암제의 치료효과를 향상시키는 연구개발이 절실한 상태이다. 따라서 면역관문저해제 끼리, 또는 화학항암제, 표적항암제, 및 방사선요법과의 병용투여 또는 병용요법을 통해 항암효과를 증진시키는 연구가 활발히 진행되고 있다.

2. 면역관문저해제 항암평가를 위한 인간화마우스 모델

인간의 종양 미세환경의 복잡성을 보다 정확히 재현하는데 인간의 면역시스템을 지닌 동물모델이 필요하고, 면역관문저해제 같은 면역치료제의 출현으로 동물모델의 사용은 점점 복잡해지고 있어, 임상반응을 예측하는데 동물모델의 활용은 더욱 신중하게 되었다. 대부분의 전임상 약물 유효성 평가는 면역부전마우스에 인간 종양세포가 이종이식된 동물 모델에서 수행되어 왔는데, 이 모델은 면역이 부전된 마우스를 사용함으로 면역세포를 타겟하는 면역항암제의 유효성 평가가 불가능하다. 때문에 인간 기능성 혈액세포 또는 줄기세포 (PBMC or CD34+)를 면역부전마우스에 이식한 면역인간화마우스가 개발되었다. 이 모델은 인간 종양세포 이종이식 및 인간 면역세포 환경에서 인간 면역항암제 유효성 평가가 가능하나 매번 면역부전마우스에 혈액세포 또는 줄기세포를 이식해야 하므로 평가하는데 오랜 기간이 걸리고 비용이 훨씬 많이 소요된다. 또한 낮은 수준의 골수 계통의 면역세포 및 불완전한 세포 발달 및 분화 등의 단점이 있다. 따라서 인간 유전자로 치환한 녹인 (Knock-In) 인간화마우스를 사용하는 것이 실험기간도 짧고 더 경제적이며 정상 면역체계를 갖기 때문에 인간항체치료제의 항암효능평가에 더 적합한 모델이다.

오늘날 임상에서 널리 사용되고 있는 항암기능이 탁월한 항체는 인간화항체이다. 면역항암제로 잘 알려진 인간 면역관문저해제 (인간 PD1 항체 등)의 개발을 위해서는 기존의 syngeneic 마우스 모델로는 효능 평가가 불가하며, 인간 면역관문유전자를 지닌 인간화마우스가 필요하다. 왜냐하면 면역관문단백질은 종간에 구조적인 차이가 있어 종양형성 중 PD1항체를 처리해도 PD1/PD-L1 axis와 같은 면역회피가 활성화되어 PD1인간화항체는 마우스에서 작동하지 않음이 밝혀져 있고 (Rangarajan 등, 2003), 본 연구팀에서도 아래와 같이 동일한 결과를 확인하였다. 즉, syngeneic 대장암 마우스 모델에서 PD1항체인 키투르다와 옵디보 등을 처리한 결과, 대조군과 동일하게 키투르다의 항암기능이 전혀 확인되지 않았다 (그림 1). 한편 본 연구팀이 개발한 PD1 유전자 인간화마우스에 MC38세포주를 이식하여 종양을 유도하고 키투르다 등의 3종의 면역항암제를 투여한 결과, 면역항암제 투여 실험군에서 유의성 있게 종양형성이 억제되는 것을 확인하였고 (그림 2), 이 결과를 통해 본 연구팀이 개발한 PD1 유전자 인간화마우스가 PD1후보항체의 효능평가에 아주 유용한 동물모델임을 확인해 주었다.

< 그림 1. Syngeneic model에서 PD1면역항암제의 효능 평가 결과 >

3. 면역관문저해제 병용치료를 위한 마우스 모델

최근 면역관문저해제는 다양한 암환자의 치료효과를 획기적으로 증진시켜 암생물학의 치료 패러다임을 바꾸어 주었으며, 특히 면역관문저해제의 병용치료는 면역치료의 임상적 유용성을 넓혀줄 것으로 기대되고 있다 (Patel 등, 2018). 따라서 면역관문저해제의 병용투여에 의한 항암효능을 비임상모델에서 평가하기 위한 최적의 마우스가 필요하다. 병용치료를 위한 항암효능평가를 위해 LAG3, TIM3, 및 TIGIT 유전자 인간화마우스가 PD1유전자 인간화마우스와 더불어 중요한 마우스이다. 왜냐하면, LAG3, TIM3, 및 TIGIT은 자극을 받은 T 세포에 과발현되어 있고 T세포의 과잉 활성을 막는 면역관문단백질로 미래의 첨단면역항암요법 타겟으로 주목을 받고 있기 때문이다 (Anderson 등, 2016). 특히 이들은 PD1인간항체의 치료 후 발현이 증가됨으로 이들 각각의 저해제는 PD1항체와의 병용투여로 항암효과를 유의성 있게 증진시키는 것으로 알려져 있다.

< 그림 2. PD1 유전자 인간화마우스에 3종의 PD1 면역항암제의 효능 평가 결과 >

이에 세계적인 실험동물전문기업을 중심으로 TIM3, TIGIT, LAG3 유전자 인간화마우스 및 PD1유전자 인간화마우스와의 이중, 삼중 인간화마우스가 만들어져 면역관문저해제의 항암효능평가에 활용되고 있으며, 본 연구팀도 TIM3와 TIGIT 유전자의 인간화마우스를 각각 제작하였다. 또한 면역관문저해제 끼리의 병용치료모델로 PD1/TIM3 및 PD1/TIGIT 유전자 인간화마우스를 제작하여 면역항암제의 항암효능평가시스템을 구축 중이다. 고로 본 지면에서는 TIM3, TIGIT, LAG3 유전자 인간화마우스의 최신 지견을 소개하고자 한다.

1) TIM3 유전자 인간화마우스

T cell immunoglobulin and mucin domain-containing protein 3 (TIM3)는 정상적인 면역반응을 조절하는 면역관문인자지만 암세포가 면역감시를 회피하는데 이용될 수 있고, 주로 기능이 소실된 T세포에서 발현되고, 그 리간드에 결합하여 TIM3 매개된 T 세포 저해를 촉진하는 것으로 알려져 있다 (Zhang 등, 2020). 인간 TIM3항체는 T세포 저해를 파기하고 항원 특이적 T세포를 활성화시켜 항암 면역을 증진시키는 것으로 보고되었다 (Zhang 등, 2020). 따라서, TIM3 유전자 인간화마우스 개발은 항암효능평가에 유용한 모델로 할용 될 수 있을 것으로 판단된다.

TIM3유전자 인간화마우스는 세계적인 실험동물전문기업들에서 개발하여 제공하고 있는데, 일반적으로 면역글로블린 유사 V-타입 도메인을 인코드하는 마우스 Tim3 유전자의 엑손 2를 인간 Tim3 엑손 2로 치환시킨 녹인 (knock-in)마우스이다. Kuang 등 (2020)은 TIM3 인간화항체 (IBI104)가 인간화 TIM3에 효율적으로 결합할 수 있고 마우스 TIM3에는 결합하지 않는 것을 확인하고, MC38종양세포를 이식한 TIM3유전자 인간화마우스에서 이 항체의 항암효능을 평가하였다. 그 결과, IBI104 단독투여로는 항암효능이 확인되지 않았고, PD1인간항체를 단독 처리한 경우, 50% 종양 성장이 줄어들었지만, TIM3 인간화항체와 PD1인간항체를 병용투여 하였을 때 항암효능이 PD1인간항체만 처리한 경우보다 유의성 있게 증가된 것을 보고함으로 TIM3 인간화항체가 PD1인간항체와의 병용치료에 활용될 수 있을 것으로 제안 되고 있다. 따라서 TIM3 유전자 인간화마우스가 TIM3인간항체와 다른 면역관문저해제와의 병용투여에 따른 항암효능평가에 유용한 마우스 모델로 판단된다.

2) TIGIT 유전자 인간화마우스

T cell immunoglobulin and ITIM domain (TIGIT)은 NK 세포와 T세포에 의해 발현되는 CD28 패밀리 유사 수용체의 일부로 이들 세포에 대한 직접적인 면역억제 효과를 발휘하고, IL-10같은 면역조절 사이토카인의 방출을 간접적으로 증가시키며, INF-gamma 와 IL-17의 생산을 감소시키고, 또한 수지상세포 (Dendritic Cells ; DCs)의 성숙을 저해하는 기능이 밝혀졌다 (Hung 등, 2018). TIGIT과 PD1을 저해하면 종양항원 (Tumor Antigen : TA) 특이적 CD8+ T 세포와 종양침투백혈구 (Tumor infiltrating lymphocytes : TIL) CD8+ T 세포의 세포증식, 사이토카인 생산 및 탈과립을 증진시켜 (Chauvin 등, 2015), 마우스 실험에서 종양 억제를 유도하는 것으로 알려져 있다 (Johnston 등, 2014). 최근 TIGIT은 면역관문 (immune checkpoint)으로 확인되었으며, TIGIT 저해제는 진행형 고형암 환자의 단독치료 또는 PD-1/PD-L1 항체와의 병용치료로 임상시험 중에 있다 (Harjunpaa 등, 2020). 이처럼 TIGIT 저해제는 단독 또는 병용치료 항암치료 효과가 보고되고 있으며, 미국 등 선진국을 포함한 우리나라 기업에서 다양한 TIGIT저해제를 개발하고 있고, 이들 항체에 대한 비임상 항암실험이 요구되고 있어, TIGIT 유전자 인간화마우스 개발은 항암효능평가에 유용한 모델로 활용될 것으로 판단된다.

Ju 등 (2020)은 마우스 TIGIT의 세포외 도메인이 사람 세포외 도메인으로 치환된 TIGIT유전자 인간화마우스를 만들고 마우스 대장암세포 MC38 또는 CT26 세포를 이식한 BALB/c 또는 C57BL/6마우스에 TIGIT인간항체를 처리한 결과, CT26 세포를 이식한 TIGIT유전자 인간화 BALB/c 마우스에서 항암효능이 강하게 관찰되었으나 MC38세포를 이식한 TIGIT유전자 인간화 C57BL/6 마우스에서는 항암효능이 확인되지 않았다. 그 결과를 조사한 결과, CT26 세포를 이식한 TIGIT유전자 인간화 BALB/c 마우스의 종양 내 NK세포와 T-reg세포 수준이 유의성 높게 증가 되어 있음을 알 수 있었고, 더 흥미로운 것은 TIGIT인간항체를 처리한 다음, T-reg세포가 완전히 소실되었다는 점이다. 따라서 TIGIT유전자 인간화 BALB/c 마우스는 TIGIT인간항체의 항암효능평가에 유용한 마우스인 것으로 확인되었다. Liu 등 (2021)은 PD-1/PD-L1/TIGIT 유전자 삼중 인간화마우스를 제작하고 MC38-hPD-L1종양 모델에서 PD-L1과 TIGIT의 인간항체 병용투여 했을 때 유의성 있는 항암효과를 볼 수 있었다.

3) LAG3 유전자 인간화마우스

lymphocyte-activation gene 3 (LAG-3)는 CD223으로도 알려져 있으며 활성화된 helper T세포와 cytotoxic T세포, regulatory T세포, 일부NK세포, B세포 등에서 발현된다. 주요 리간드는 MHC-II (Major histocompatibility complex ; 주요조직적합성 복합체)이다. PD-1과 마찬가지로 T세포의 활성화와 사이토카인을 억제하는 역할을 하며, 암세포가 분화할 때 면역 감시를 피하기 위해 LAG-3 경로를 이용한다. 따라서 LAG-3를 저해하면 면역세포가 활성화되고 암세포의 성장이 억제될 것으로 예상하며, 특히 PD-1 내성을 지연시키거나 극복할 수 있을 것으로 기대되어 Lag3 저해제의 개발에 유명 제약사들이 참여하고 있다.

Burova 등 (2019)은 마우스 세포외 도메인이 사람 세포외 도메인으로 치환된 PD-1/LAG3 유전자 이중 인간화마우스를 제작하고, 이들 마우스 종양모델에서 PD1인간항체와 LAG3인간항체의 병용투여에 의한 항암효능을 평가한 결과를 보고한 바 있고, Li 등 (2021)도 LAG-3인간항체의 항암효능평가를 위해 LAG-3 유전자 인간화마우스를 생산하였는데, 그들은 세포외 도메인을 인코드하는 마우스 LAG-3 유전자의 엑손 2-7이 인간 LAG-3 엑손 2-7으로 치환하는 방식으로 제작하고, LAG-3인간항체의 항암효능을 평가한 결과를 보고하였고, 또한 PD-1/PD-L1/LAG3 유전자 삼중 인간화마우스를 제작하고 MC38종양모델에서 LAG-3인간항체가 PD1인간항체와 병용 투여하였을 때 시너지 항암효과를 볼 수 있었다고 보고하였다.

4. 맺는말

2011년 CTLA4 항체가 전이성 흑색종의 치료를 위해 허가받은 이래, 면역관문인자는 암치료타겟으로 암연구의 대세를 이루고 있으며, PD1 및 CTLA4 항체 이외의 효능이 탁월한 면역관문저해제를 찾기 위한 연구가 지속적으로 이루어져, 상기 언급한 TIM3, TIGIT, LAG3 등 인간 항체가 개발되어 비임상 또는 임상시험 중에 있다. 하지만 차세대 항암제로 각광을 받은 면역관문저해제도 항암효능이 일부 환자에 국한되어 있고 저해제의 투여에 따른 내성이 생겨, 이러한 문제점을 극복하기 위한 연구가 절실한 상태이다. 최근 암치료에는 병용요법이 단독요법보다 탁월한 효능을 보이고 있어 면역항암제와의 병용치료가 대세이며, 병용투여에 따른 항암효능을 평가하기 위한 인간화마우스의 개발 및 활용이 중요하게 되었다. 상기 언급한 3종의 면역관문유전자 인간화마우스 및 PD1유전자 인간화마우스와의 이중, 3중 인간화마우스는 병용요법의 비임상 효능평가에 유용하게 활용되어 암환자들에게 좀 더 희망을 주는 치료법이 제공되길 기대한다.

5. 참고문헌

[1] Anderson AC, et al., Lag-3, Tim-3, and TIGIT co-inhibitory receptors with specialized functions in immune regulation. Immunity. 2016 May 17; 44(5): 989–1004.

[2] Burova Elena et al. Preclinical Development of the Anti-LAG-3 Antibody REGN3767: Characterization and Activity in Combination with the Anti-PD-1 Antibody Cemiplimab in Human PD-1 x LAG-3-Knockin Mice. Mol Cancer Ther. 2019 Nov;18(11):2051-2062.
[3] Chauvin JM et al.. TIGIT and PD-1 impair tumor antigen–specific CD8⁺ T cells in melanoma patients J Clin Invest.2015, 125 (5): 2046–2058.

[4] Harjunpaa H and Guillerey. TIGIT as an emerging immune checkpoint. Clin Exp Immunol 2020, 200(2):108-119
[5] Hung AL et al.. TIGIT and PD-1 dual checkpoint blockade enhances antitumor immunity and survival in GBM Oncoimmunology. 2018; 7(8): e1466769

[6] Johnston RJ et al.. The Immunoreceptor TIGIT Regulates Antitumor and Antiviral CD8⁺ T Cell Effector Function Cancer Cell. 2014, 26 (6): 923–937)

[7] Ju Cunxiang et al.. TIGIT humanized BALB/c mouse: A novel animal model for preclinical studies of human TIGIT antibodies. Cancer Res (2020) 80 (16_Supplement): 3256
[8] Li et al., Improved LAG-3 humanized knock-in mouse model for assessment of mono- and combination therapy strategies for cancer treatment. Cancer Res (2021) 81 (13_Supplement): 2942.
[9] Kuang Z et al., A novel antibody targeting TIM-3 resulting in receptor internalization for cancer immunotherapy. Antib Ther. 2020 Dec; 3(4): 227–236.
[10] Liu Chonghui et al. A novel humanized B-hPD-1/hPD-L1/hTIGIT mouse model reveals enhanced efficacy of combined TIGIT and PD-L1 blockade against cancer. Cancer Res (2021) 81 (13_Supplement): 493.
[11] Rangarajan A & Weinberg RA. Nat. Rev. Cancer 2003, 3, 952–959

[12] Patel SA, Minn AJ. Combination Cancer Therapy with Immune Checkpoint Blockade: Mechanisms and Strategies. Immunity, 2018, 48(3): 417-433

[13] Zhang D et al., Identification and characterization of M6903, an antagonistic anti–TIM-3 monoclonal antibody. Oncoimmunology 2020,9(1), 1744921

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