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한국실험동물학회 뉴스레터	2023년 6월
[질환모델동물] 치주염 및 관련 전신질환 연구를 위한 마우스 모델

치주염 및 관련 전신질환 연구를 위한 마우스 모델 부산대학교 치의학전문대학원 김형식 (hskimcell@pusan.ac.kr) 서론 치주질환은 구강 내 병원성 세균에 의해 형성된 치태 및 치석으로 인해 치아 주위 조직에 발생한 염증이 만성화되어 치아를 지지하는 치조골까지 파괴할 수 있는 질환입니다. 2019년부터 현재까지 외래진료 다빈도 질환 1위를 차지하고 있으며 고령화 사회와 더불어 큰 폭으로 증가하고 있습니다. 심한 경우 염증의 확산을 방지하기 위해 발치가 요구되며 이후 고가의 임플란트 치료로 인한 경제적 문제가 발생합니다. 또한 치주질환이 다양한 전신질환의 발병 및 악화에 영향을 준다는 것이 보고되면서 치료와 예방을 위한 연구가 더욱 필요한 상황이 되었습니다. 치주질환 발생과 진행에 영향을 주는 위험 요인을 조사하고 치료 및 예후를 평가하기 위해서 다양한 치주염 유발 마우스 모델이 사용되고 있습니다. 본론 1. 치주질환 마우스 모델의 종류 마우스를 이용한 모델은 치주염 유발 시 재현성 높은 치주 염증 반응이 관찰되며 상대적으로 저렴하고 다루기 쉬우며 임신 기간이 짧다는 장점이 있습니다. 마우스 치주염 모델은 방법에 따라 크게 결찰 유도 모델과 세균 주입 모델, 두 가지로 나눌 수 있습니다. 1.1. 결찰 유도 치주염 모델 결찰 유도 치주염(ligature-induced periodontitis) 모델은 상악 또는 하악 대구치 주위에 실크, 나일론 또는 면 결찰을 배치하여 제작할 수 있습니다 (그림1). 결찰 부위 주변에 세균 플라크가 축적되고 지속적인 면역 반응이 일어나 치주 염증 및 치조골 손실이 유발됩니다. 이 모델은 사람의 치주염과 유사한 환경을 모방할 수 있어 일반적으로 많이 사용되고 있습니다. 결찰 후 치조골 손실의 차이는 5일 후부터 확인 가능하며 주변 치주 조직에서 염증 지표 발현을 동반합니다. 이 후 결찰을 제거하여 병변 치유 및 염증 완화에 관한 연구도 가능합니다. 1.2. 병원성 세균 주입 모델 또 다른 방법으로 치주염 유발 병원균이나 lipopolysaccharide(LPS) 와 같은 병원균 유래 성분을 마우스에 직접 주입하는 방법도 사용되고 있습니다. 사람의 대표적인 치주질환 유발균인 Porphyromonas gingivalis (P. gingivalis), Fusobacterium nucleatum, Aggregatibacter actinomycetemcomitans 등을 처치하는 형태로 치주염을 유도하며 균의 처치 주기 및 기간은 실험 목적에 따라 매우 다양하게 설정됩니다. 목적에 따라 세균을 국소적으로 마우스의 치간 치은에 접종하거나 존데 및 마이크로피펫을 이용하여 경구투여로 주입할 수 있습니다. 이 모델은 결찰 유도 모델에 비해 염증반응과 치조골 손실의 재현성이 낮고 비교적 오랜 시간이 소요됩니다. 최근에는 효과적인 치주염 모델을 확립하기 위해서 결찰 유도 모델에 세균을 같이 주입하는 방법이 많이 사용되고 있습니다. 1.3. 주요 분석지표 1.3.1. 사이토카인 병원성 세균은 치주 조직에서 숙주 면역반응을 자극하여 염증 매개체와 사이토카인의 방출을 유발하고 결국 연조직의 파괴 및 치조골 흡수를 초래합니다. 다양한 종류의 사이토카인은 치주질환의 진행을 조절할 수 있습니다 (그림2). IL-1β, IL-6, TNF-α 및 RANKL과 같은 사이토카인은 치주염에서 파골세포 형성을 촉진하여 골 흡수를 촉진 시킨다고 알려져 있습니다. IL-10 은 항 염증성 사이토카인으로 전 염증성 사이토카인 (IL-1α, IL-1β, IL-6, TNF-α 등)의 발현을 억제하여 염증 반응을 제어할 수 있습니다. 1.3.2. 치조골 손실 분석 치주염의 가장 큰 특징은 염증이 지속됨에 따른 치조골 손실과 치은, 치주인대, 백악질과 같은 조직의 파괴입니다. 치조골 손실 (alveolar bone loss)은 핵심적인 치주염 모델의 분석 지표 중 하나로 microCT를 이용한 길이 및 형태 측정이나 조직학적 분석을 통해 평가할 수 있습니다. 치조골 손실 정도를 수치화 하기위해서 CEJ(cemento-enamel junction)와 ABC(alveolar bone crest) 사이의 거리를 측정합니다. 2. 치주염과 전신질환 복합모델 치주질환의 원인이 되는 병원성 세균과 염증세포 및 매개체는 전신으로 퍼져 다른 조직의 균형을 파괴하거나 염증을 유발하여 다양한 전신질환을 악화시킬 수 있습니다. 치주질환과 전신질환의 양방향 상관관계 연구를 위해 다양한 질환과 관련된 복합모델이 사용되고 있습니다 (그림3). 2.1. 심혈관질환 많은 임상연구 및 역학연구에서 치주염과 심혈관질환의 명확한 연관성이 보고되었습니다. 치주질환 환자는 건강한 사람에 비해 심혈관질환 위험이 19% 높은 것으로 나타났으며 죽상 경화증 환자 표본의 48%에서 치주질환 유발 균의 DNA가 검출되었습니다. 심혈관질환 연구에는 고콜레스테롤혈증 및 죽상 동맥경화증을 유발하는 ApoE 결핍 마우스가 주로 사용되며 이 모델에 결찰과 함께 P. gingivalis 및 F. nucleatum을 감염시킨 연구가 보고되었습니다. 치주질환 유발균은 동맥경화증을 유발하는 죽종형성(atherogenesis)을 악화시키고 혈관 내피 세포의 변형 및 전신 염증을 유발하는 것으로 보고되었습니다. 2.2. 대사성 간질환 대사성 간질환은 간 지방증을 동반한 대사장애를 특징으로 하며 다수의 역학연구에서 중증 치주질환과 높은 상관관계가 있다고 보고되었습니다. 결찰과 병행한 P. gingivalis 감염은 간질환이 유발되지 않은 마우스에서도 인슐린 저항성과 다양한 염증성 사이토카인 발현을 증가시켰습니다. 복합모델 제작을 위해서 고지방식이 섭취를 통해 간질환을 유도한 마우스에 경구투여, 치은 주사 및 정맥 주사로 병원성 세균을 감염시키거나 결찰을 유도한 모델이 사용되었습니다. 치주질환과 간질환 복합모델에서 간 염증 지표 수준이 유의하게 악화되고 당내성과 인슐린 저항성이 증가하였습니다. 2.3. 당뇨병 및 비만 당뇨병성 치주염 환자는 당뇨병이 없는 환자에 비해 치조골 손실이 더 크게 나타나고 치료 후 예후가 좋지 않다고 보고되었습니다. 제2형 당뇨병 및 비만 모델인 db/db 마우스와 STZ(streptozotocin) 유도 당뇨병 마우스를 P. gingivalis를 감염시키면 wild type 마우스에 비해 심각한 치조골 손실과 염증 지표의 증가가 동반되었습니다. 고지방식이를 섭취한 비만 마우스 모델에 결찰을 병행한 경우 백혈구 및 대식세포의 증가와 함께 다양한 염증성 사이토카인 분비가 촉진되었습니다. 2.4. 알츠하이머병 최근, 치주질환과 그 병원균인 P. gingivalis가 알츠하이머병의 중요한 위험요소라는 연구결과가 보고되었습니다. 만성 치주염을 가진 알츠하이머 환자는 그렇지 않은 환자에 비해 현저히 낮은 인지능력을 보였습니다. 마우스 모델에서 P. gingivalis의 경구 감염은 뇌에서 성공적으로 집락을 형성할 수 있었으며 신경 기능에 영향을 미쳤습니다. 알츠하이머병의 마우스 모델인 5xFAD 형질전환 마우스는 뇌에서 높은 수준의 Aβ42 축적으로 인한 신경세포의 손실이 관찰됩니다. 5xFAD 마우스에 결찰 유도를 통한 치주염이 동반되면 wildtype에 비해 대뇌피질의 Aβ42를 증가가 관찰되었습니다. 또 다른 알츠하이머 모델인 삼중 형질전환 (3xTg-AD) 마우스에서도 치주염 유도에 의해 더욱 증가된 신경 염증이 확인되었습니다. 2.5. 류마티스 관절염 최근 보고된 바에 따르면 류마티스 관절염 환자에서 더 많은 치주질환과 관련된 세균의 수 및 종류가 검출되며 치주질환과의 높은 상관성이 제시되고 있습니다. 콜라겐 유도 관절염 (CIA) 모델은 류마티스 관절염과 유사한 증상을 나타내어 해당 질환 연구를 위해 일반적으로 사용되는데 CIA 마우스에서 P. gingivalis 감염은 류마티스 관절염의 면역학적 특징 중 하나인 혈청 내 시트룰린화된 단백질을 증가시키고 조직학적 질병 중증도를 악화시켰습니다. 맺음말 치주염에서 숙주-미생물 상호작용 및 염증 기전을 조사하고, 나아가 치주염과 전신질환의 상호작용 기전을 분석하기 위해서 적절한 마우스 모델을 선택하고 확립된 지표를 통해 모델을 평가하는 것은 중요합니다. 최근 확립된 치주염 마우스 모델은 충분한 신뢰성과 효율성을 나타내고 있어 치주염 발병 기전과 치료 기술 개발 연구에 널리 활용될 수 있을 것으로 생각됩니다. 참조 1. Chipashvili, O. & Bor, B. Ligature-induced periodontitis mouse model protocol for studying Saccharibacteria. STAR Protoc 3, 101167, doi:10.1016/j.xpro.2022.101167 (2022). 2. Kantarci, A. et al. Microglial response to experimental periodontitis in a murine model of Alzheimer's disease. Sci Rep 10, 18561, doi:10.1038/s41598-020-75517-4 (2020). 3. Lalla, E. et al. Oral infection with a periodontal pathogen accelerates early atherosclerosis in apolipoprotein E-null mice. Arterioscler Thromb Vasc Biol 23, 1405-1411, doi:10.1161/01.ATV.0000082462.26258.FE (2003). 4. Lalla, E. & Papapanou, P. N. Diabetes mellitus and periodontitis: a tale of two common interrelated diseases. Nat Rev Endocrinol 7, 738-748, doi:10.1038/nrendo.2011.106 (2011). 5. Lin, P. et al. Application of Ligature-Induced Periodontitis in Mice to Explore the Molecular Mechanism of Periodontal Disease. Int J Mol Sci 22, doi:10.3390/ijms22168900 (2021). 6. Marchesan, J. et al. An experimental murine model to study periodontitis. Nat Protoc 13, 2247-2267, doi:10.1038/s41596-018-0035-4 (2018). 7. Pan, W., Wang, Q. & Chen, Q. The cytokine network involved in the host immune response to periodontitis. Int J Oral Sci 11, 30, doi:10.1038/s41368-019-0064-z (2019). 8. Ribeiro, A. B. et al. Cardiovascular and Autonomic Dysfunction in Murine Ligature-Induced Periodontitis. Sci Rep 10, 6891, doi:10.1038/s41598-020-63953-1 (2020). 9. Zhang, X., Xu, M., Xue, Q. & He, Y. A modified method for constructing experimental rat periodontitis model. Front Bioeng Biotechnol 10, 1098015, doi:10.3389/fbioe.2022.1098015 (2022). 10. Zhang, X., Xu, M., Xue, Q. & He, Y. Corrigendum: A modified method for constructing experimental rat periodontitis model. Front Bioeng Biotechnol 11, 1177628, doi:10.3389/fbioe.2023.1177628 (2023).

치주염 및 관련 전신질환 연구를 위한 마우스 모델

부산대학교 치의학전문대학원

김형식 (hskimcell@pusan.ac.kr)

서론

치주질환은 구강 내 병원성 세균에 의해 형성된 치태 및 치석으로 인해 치아 주위 조직에 발생한 염증이 만성화되어 치아를 지지하는 치조골까지 파괴할 수 있는 질환입니다. 2019년부터 현재까지 외래진료 다빈도 질환 1위를 차지하고 있으며 고령화 사회와 더불어 큰 폭으로 증가하고 있습니다. 심한 경우 염증의 확산을 방지하기 위해 발치가 요구되며 이후 고가의 임플란트 치료로 인한 경제적 문제가 발생합니다. 또한 치주질환이 다양한 전신질환의 발병 및 악화에 영향을 준다는 것이 보고되면서 치료와 예방을 위한 연구가 더욱 필요한 상황이 되었습니다. 치주질환 발생과 진행에 영향을 주는 위험 요인을 조사하고 치료 및 예후를 평가하기 위해서 다양한 치주염 유발 마우스 모델이 사용되고 있습니다.

본론

1. 치주질환 마우스 모델의 종류

마우스를 이용한 모델은 치주염 유발 시 재현성 높은 치주 염증 반응이 관찰되며 상대적으로 저렴하고 다루기 쉬우며 임신 기간이 짧다는 장점이 있습니다. 마우스 치주염 모델은 방법에 따라 크게 결찰 유도 모델과 세균 주입 모델, 두 가지로 나눌 수 있습니다.

1.1. 결찰 유도 치주염 모델

결찰 유도 치주염(ligature-induced periodontitis) 모델은 상악 또는 하악 대구치 주위에 실크, 나일론 또는 면 결찰을 배치하여 제작할 수 있습니다 (그림1). 결찰 부위 주변에 세균 플라크가 축적되고 지속적인 면역 반응이 일어나 치주 염증 및 치조골 손실이 유발됩니다. 이 모델은 사람의 치주염과 유사한 환경을 모방할 수 있어 일반적으로 많이 사용되고 있습니다. 결찰 후 치조골 손실의 차이는 5일 후부터 확인 가능하며 주변 치주 조직에서 염증 지표 발현을 동반합니다. 이 후 결찰을 제거하여 병변 치유 및 염증 완화에 관한 연구도 가능합니다.

1.2. 병원성 세균 주입 모델

또 다른 방법으로 치주염 유발 병원균이나 lipopolysaccharide(LPS) 와 같은 병원균 유래 성분을 마우스에 직접 주입하는 방법도 사용되고 있습니다. 사람의 대표적인 치주질환 유발균인 Porphyromonas gingivalis (P. gingivalis), Fusobacterium nucleatum, Aggregatibacter actinomycetemcomitans 등을 처치하는 형태로 치주염을 유도하며 균의 처치 주기 및 기간은 실험 목적에 따라 매우 다양하게 설정됩니다. 목적에 따라 세균을 국소적으로 마우스의 치간 치은에 접종하거나 존데 및 마이크로피펫을 이용하여 경구투여로 주입할 수 있습니다. 이 모델은 결찰 유도 모델에 비해 염증반응과 치조골 손실의 재현성이 낮고 비교적 오랜 시간이 소요됩니다. 최근에는 효과적인 치주염 모델을 확립하기 위해서 결찰 유도 모델에 세균을 같이 주입하는 방법이 많이 사용되고 있습니다.

1.3. 주요 분석지표

1.3.1. 사이토카인

병원성 세균은 치주 조직에서 숙주 면역반응을 자극하여 염증 매개체와 사이토카인의 방출을 유발하고 결국 연조직의 파괴 및 치조골 흡수를 초래합니다. 다양한 종류의 사이토카인은 치주질환의 진행을 조절할 수 있습니다 (그림2). IL-1β, IL-6, TNF-α 및 RANKL과 같은 사이토카인은 치주염에서 파골세포 형성을 촉진하여 골 흡수를 촉진 시킨다고 알려져 있습니다. IL-10 은 항 염증성 사이토카인으로 전 염증성 사이토카인 (IL-1α, IL-1β, IL-6, TNF-α 등)의 발현을 억제하여 염증 반응을 제어할 수 있습니다.

1.3.2. 치조골 손실 분석

치주염의 가장 큰 특징은 염증이 지속됨에 따른 치조골 손실과 치은, 치주인대, 백악질과 같은 조직의 파괴입니다. 치조골 손실 (alveolar bone loss)은 핵심적인 치주염 모델의 분석 지표 중 하나로 microCT를 이용한 길이 및 형태 측정이나 조직학적 분석을 통해 평가할 수 있습니다. 치조골 손실 정도를 수치화 하기위해서 CEJ(cemento-enamel junction)와 ABC(alveolar bone crest) 사이의 거리를 측정합니다.

2. 치주염과 전신질환 복합모델

치주질환의 원인이 되는 병원성 세균과 염증세포 및 매개체는 전신으로 퍼져 다른 조직의 균형을 파괴하거나 염증을 유발하여 다양한 전신질환을 악화시킬 수 있습니다. 치주질환과 전신질환의 양방향 상관관계 연구를 위해 다양한 질환과 관련된 복합모델이 사용되고 있습니다 (그림3).

2.1. 심혈관질환

많은 임상연구 및 역학연구에서 치주염과 심혈관질환의 명확한 연관성이 보고되었습니다. 치주질환 환자는 건강한 사람에 비해 심혈관질환 위험이 19% 높은 것으로 나타났으며 죽상 경화증 환자 표본의 48%에서 치주질환 유발 균의 DNA가 검출되었습니다. 심혈관질환 연구에는 고콜레스테롤혈증 및 죽상 동맥경화증을 유발하는 ApoE 결핍 마우스가 주로 사용되며 이 모델에 결찰과 함께 P. gingivalis 및 F. nucleatum을 감염시킨 연구가 보고되었습니다. 치주질환 유발균은 동맥경화증을 유발하는 죽종형성(atherogenesis)을 악화시키고 혈관 내피 세포의 변형 및 전신 염증을 유발하는 것으로 보고되었습니다.

2.2. 대사성 간질환

대사성 간질환은 간 지방증을 동반한 대사장애를 특징으로 하며 다수의 역학연구에서 중증 치주질환과 높은 상관관계가 있다고 보고되었습니다. 결찰과 병행한 P. gingivalis 감염은 간질환이 유발되지 않은 마우스에서도 인슐린 저항성과 다양한 염증성 사이토카인 발현을 증가시켰습니다. 복합모델 제작을 위해서 고지방식이 섭취를 통해 간질환을 유도한 마우스에 경구투여, 치은 주사 및 정맥 주사로 병원성 세균을 감염시키거나 결찰을 유도한 모델이 사용되었습니다. 치주질환과 간질환 복합모델에서 간 염증 지표 수준이 유의하게 악화되고 당내성과 인슐린 저항성이 증가하였습니다.

2.3. 당뇨병 및 비만

당뇨병성 치주염 환자는 당뇨병이 없는 환자에 비해 치조골 손실이 더 크게 나타나고 치료 후 예후가 좋지 않다고 보고되었습니다. 제2형 당뇨병 및 비만 모델인 db/db 마우스와 STZ(streptozotocin) 유도 당뇨병 마우스를 P. gingivalis를 감염시키면 wild type 마우스에 비해 심각한 치조골 손실과 염증 지표의 증가가 동반되었습니다. 고지방식이를 섭취한 비만 마우스 모델에 결찰을 병행한 경우 백혈구 및 대식세포의 증가와 함께 다양한 염증성 사이토카인 분비가 촉진되었습니다.

2.4. 알츠하이머병

최근, 치주질환과 그 병원균인 P. gingivalis가 알츠하이머병의 중요한 위험요소라는 연구결과가 보고되었습니다. 만성 치주염을 가진 알츠하이머 환자는 그렇지 않은 환자에 비해 현저히 낮은 인지능력을 보였습니다. 마우스 모델에서 P. gingivalis의 경구 감염은 뇌에서 성공적으로 집락을 형성할 수 있었으며 신경 기능에 영향을 미쳤습니다. 알츠하이머병의 마우스 모델인 5xFAD 형질전환 마우스는 뇌에서 높은 수준의 Aβ42 축적으로 인한 신경세포의 손실이 관찰됩니다. 5xFAD 마우스에 결찰 유도를 통한 치주염이 동반되면 wildtype에 비해 대뇌피질의 Aβ42를 증가가 관찰되었습니다. 또 다른 알츠하이머 모델인 삼중 형질전환 (3xTg-AD) 마우스에서도 치주염 유도에 의해 더욱 증가된 신경 염증이 확인되었습니다.

2.5. 류마티스 관절염

최근 보고된 바에 따르면 류마티스 관절염 환자에서 더 많은 치주질환과 관련된 세균의 수 및 종류가 검출되며 치주질환과의 높은 상관성이 제시되고 있습니다. 콜라겐 유도 관절염 (CIA) 모델은 류마티스 관절염과 유사한 증상을 나타내어 해당 질환 연구를 위해 일반적으로 사용되는데 CIA 마우스에서 P. gingivalis 감염은 류마티스 관절염의 면역학적 특징 중 하나인 혈청 내 시트룰린화된 단백질을 증가시키고 조직학적 질병 중증도를 악화시켰습니다.

맺음말

치주염에서 숙주-미생물 상호작용 및 염증 기전을 조사하고, 나아가 치주염과 전신질환의 상호작용 기전을 분석하기 위해서 적절한 마우스 모델을 선택하고 확립된 지표를 통해 모델을 평가하는 것은 중요합니다. 최근 확립된 치주염 마우스 모델은 충분한 신뢰성과 효율성을 나타내고 있어 치주염 발병 기전과 치료 기술 개발 연구에 널리 활용될 수 있을 것으로 생각됩니다.

참조

1. Chipashvili, O. & Bor, B. Ligature-induced periodontitis mouse model protocol for studying Saccharibacteria. STAR Protoc 3, 101167, doi:10.1016/j.xpro.2022.101167 (2022).

2. Kantarci, A. et al. Microglial response to experimental periodontitis in a murine model of Alzheimer's disease. Sci Rep 10, 18561, doi:10.1038/s41598-020-75517-4 (2020).

3. Lalla, E. et al. Oral infection with a periodontal pathogen accelerates early atherosclerosis in apolipoprotein E-null mice. Arterioscler Thromb Vasc Biol 23, 1405-1411, doi:10.1161/01.ATV.0000082462.26258.FE (2003).

4. Lalla, E. & Papapanou, P. N. Diabetes mellitus and periodontitis: a tale of two common interrelated diseases. Nat Rev Endocrinol 7, 738-748, doi:10.1038/nrendo.2011.106 (2011).

5. Lin, P. et al. Application of Ligature-Induced Periodontitis in Mice to Explore the Molecular Mechanism of Periodontal Disease. Int J Mol Sci 22, doi:10.3390/ijms22168900 (2021).

6. Marchesan, J. et al. An experimental murine model to study periodontitis. Nat Protoc 13, 2247-2267, doi:10.1038/s41596-018-0035-4 (2018).

7. Pan, W., Wang, Q. & Chen, Q. The cytokine network involved in the host immune response to periodontitis. Int J Oral Sci 11, 30, doi:10.1038/s41368-019-0064-z (2019).

8. Ribeiro, A. B. et al. Cardiovascular and Autonomic Dysfunction in Murine Ligature-Induced Periodontitis. Sci Rep 10, 6891, doi:10.1038/s41598-020-63953-1 (2020).

9. Zhang, X., Xu, M., Xue, Q. & He, Y. A modified method for constructing experimental rat periodontitis model. Front Bioeng Biotechnol 10, 1098015, doi:10.3389/fbioe.2022.1098015 (2022).

10. Zhang, X., Xu, M., Xue, Q. & He, Y. Corrigendum: A modified method for constructing experimental rat periodontitis model. Front Bioeng Biotechnol 11, 1177628, doi:10.3389/fbioe.2023.1177628 (2023).

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