폐 섬유증 모델을 기반으로 인간화 B-hCCN2 마우스에서
항CCN2 항체의 효능 평가
Biocytogen 한국 공식대리점
㈜한국비임상기술지원센터 마케팅 총괄
소개
폐 섬유증은 폐 조직이 상처를 입어 호흡 곤란을 일으키는 자가면역 질환입니다. 유럽에서 폐 섬유증으로 고통받는 환자는 80,000명 이상인 것으로 추산됩니다. 특발성 폐섬유증(IPF)은 질병의 가장 흔한 형태이며 IPF와 관련된 사망의 가장 흔한 원인은 호흡 부전입니다. 주로 폐 미세혈관 내피세포, 폐포 상피세포, 기저막, 폐혈관, 주변 림프조직을 침범한다. 폐섬유증은 완치가 불가능한 질환으로 예후가 좋지 않으며 폐섬유증 환자의 5년 생존율은 약 30%에 불과합니다[1].
폐 섬유증의 많은 마우스 모델은 가장 일반적으로 사용되는 모델인 블레오마이신 유발 폐 섬유증과 함께 기계적 및 치료 연구를 위해 개발되었습니다. Biocytogen은 블레오마이신의 기관내 주입으로 폐 섬유증 모델을 성공적으로 구축했습니다. 신속하고 경제적이며 안정적으로 모델을 구축할 수 있습니다. 한편, 생쥐에서 블레오마이신에 의해 유도된 폐 섬유증은 생식력이 높으며 환자, 특히 항신생물제로서 블레오마이신으로 치료받은 환자에서 관찰되는 주요 조직학적 특성을 모방합니다[2]. 저분자 약물, 핵산 약물, 고분자 약물 등의 생체 내 약물 효능을 평가하는 데 사용할 수 있습니다.
그림1. 폐 섬유증 유도에서 블레오마이신의 효과.[2]
결합 조직 성장 인자로도 알려진 세포 통신 네트워크 인자 2(CCN2)는 모듈 모세포 단백질의 CCN(CCN1-6) 계열의 구성원입니다[3]. CCN2는 세포 부착, 증식, 생존, 이동 및 세포외 기질 생성을 조절하는 것 외에도 발생 중 연골 형성과 신장 섬유증 및 폐 섬유증과 같은 질병의 필수 조절자 역할을 합니다. 따라서 CCN2 작용제의 개발은 폐 섬유증에 대한 유망한 치료 옵션인 것으로 보입니다. 전임상 연구에서 CCN2 유사체의 효능을 평가하기 위해 Biocytogen은 관련 약물 개발 연구를 지원하기 위해 새로운 인간화 CCN2(B-hCCN2) 녹인 마우스 라인을 성공적으로 생성했습니다. Biocytogen은 인간화 B-hCCN2 마우스에서 블레오마이신에 의해 유도된 폐 섬유증 모델을 만들었습니다. 이 연구에서 pamrevlumab(사내)을 사용하여 B-hCCN2 마우스를 블레오마이신 유발 폐 섬유증으로 치료했습니다. 생체 내 효능 연구에서 항인간 CCN2 항체인 pamrevlumab이 체중 감소를 완화하고 폐 섬유증이 있는 마우스의 생존율을 연장했으며 폐 염증 세포의 비율과 폐 섬유증 정도를 하향 조절했음을 확인했습니다. 전체적으로, B-hCCN2 마우스는 CCN2 기반 치료제를 평가하기 위한 효과적인 전임상 동물 모델을 제공하고, pamrevlumab은 인간화 B-hCCN2 마우스에서 폐 섬유증 표현형을 효과적으로 약화시킵니다.
결과
1. 인간화 B-hCCN2 마우스에서 CCN2 발현 분석
Biocytogen은 먼저 C57BL/6 마우스 배경에서 B-hCCN2 마우스를 구성했습니다. RT-PCR에 의해 야생형 마우스(+/+) 및 B-hCCN2 마우스에서 CCN2의 유전자 발현을 분석하였습니다. 마우스 CCN2 mRNA는 야생형 마우스의 신장에서 검출가능하였습니다(+/+). 인간 CCN2 mRNA는 동형접합 B-hCCN1 마우스(H/H)에서만 검출 가능했지만 야생형 마우스(+/+)에서는 검출되지 않았습니다(그림 2A). 야생형 마우스(+/+) 및 B-hCCN2 마우스에서 CCN2의 단백질 발현을 웨스턴 블롯으로 분석하였습니다. 마우스 CCN2 단백질은 야생형 마우스의 신장에서 검출가능하였습니다(+/+). 인간 CCN2 단백질은 동형접합체 B-hCCN1 마우스(H/H)에서만 검출 가능했지만 야생형 마우스(+/+)에서는 검출되지 않았습니다(그림 2B). 이러한 결과는 마우스 CCN2가 B-hCCN1 마우스에서 인간 CCN2로 성공적으로 대체되었음을 나타냅니다.
그림2. 인간화 B-hCCN2 마우스의 CCN2 발현 분석.
(A) 야생형 C57BL/6(+/+) 및 동형접합 B-hCCN2(H/H) 마우스에서 신장 조직을 추출하고 RT-PCR로 분석했습니다.
(B) 항-인간/마우스 CCN2 항체를 사용하여, 웨스턴 블롯 분석에 의해 동형접합 인간화 B-hCCN2 마우스에서 인간 CCN2 단백질을 검출하였다.
2. 인간화 B-hCCN2 마우스에서 Pamrevlumab의 모델 확립 및 생체 내 효능
Biocytogen은 B-hCCN2 마우스에서 안정적인 폐 섬유증 질환 모델을 확립했으며, 모델 도식을 타격으로 수행했습니다(그림 3). 간략하게, 인간화 B-hCCN2 마우스에게 블레오마이신 i.t. 첫 번째 투약일에, 마우스는 vehicle 또는 Pamrevlumab(10mg/kg) 중 하나를 복강내 용량으로 투여받았고 2시간 후에는 isoflurane 마취하에 블레오마이신을 20μg/50μl/마우스 용량으로 기관내 점적했습니다. 그 후 마우스는 Pamrevlumab과 vehicle을 격일로 받아 총 7회 용량을 제공하고 14일째에 중단했습니다. B-hCCN2 마우스는 1개의 식염수 비-블레오마이신 대조군(n=4)과 2개의 블레오마이신 처리된 섬유증 그룹(n =9) pamrevlumab(in-house, anti-human CCN2)또는 vehicle로 처리되었습니다.
그림3. 폐 섬유증 마우스 모델의 개략도.
3. 폐 섬유증으로 유도된 인간화 B-hCCN2 마우스의 체중 변화 및 생존율
모델링 그룹에서 블레오마이신의 기도 주입 후 현저한 체중 감소와 호흡 부전으로 인한 사망이 있었습니다. Pamrevlumab 처리는 B-hCCN2 마우스에서 블레오마이신 유도 체중 감소를 개선할 수 있었고(그림 4A-B) 블레오마이신으로 인한 사망률을 감소시킬 수 있었습니다(그림 4C).
그림4. (A-B) 치료 중 체중 및 체중 변화. (C) 마우스의 전반적인 생존. 값은 평균 ± SEM으로 표시됩니다.
L-Hydroxyproline (HYP)은 특발성 폐 섬유증(IPF)의 중요한 바이오마커입니다. 오른쪽 마우스 폐의 Hydroxyproline 함량을 사용하여 폐 콜라겐 함량을 정량화하고 상업용 키트로 비색 측정했습니다. 블레오마이신 처리는 대조군에 비해 HYP 함량을 증가시킨다. vehicle 처리된 블레오마이신 대조군과 비교하여, pamrevlumab 처리는 Pamrevlumab에 의한 플라스민 활성의 억제를 암시하는 평균 유도된 폐 HYP 함량의 감소를 가져왔습니다(그림 5).
그림5. 폐 hydroxyproline 의 함량은 μg의 hydroxyproline /오른쪽 폐로 표시됩니다. 값은 평균 ± SEM으로 표시됩니다. *** p<0.001, **p<0.01.
그림6. 폐섬유증 마우스 모델에서 H&E 및 Masson 염색 분석.
(A) 폐 섬유증 마우스 모델의 H&E 염색의 대표 사진.
(B) 폐 섬유증 마우스 모델의 Masson 염색의 대표 사진. 축척 막대: 200μm.
결론
이 연구에서 우리는 뮤린 대응 물 대신 인간 CCN2를 표현하는 인간화 마우스 모델을 성공적으로 생성했습니다. 인간 CCN2의 mRNA 및 단백질 발현은 인간화 모델의 성공적인 생성을 나타냅니다. 모델링 그룹에서 블레오마이신의 기도 주사 후 2주째 상당한 체중 감소가 있었고 호흡 부전으로 사망했으며, 체중 감소가 완화되었고 pamrevlumab 처리 후 마우스가 사망하지 않았습니다. 병리학적 결과는 모델링 그룹에서 염증성 침윤 및 콜라겐 섬유 침착, 폐 염증 세포(단핵구가 우세함)의 비율 및 pamrevlumab 치료 후 폐 섬유화 정도가 감소하는 것으로 나타났습니다. B-hCCN2 마우스에서 Bleomycin 유발 폐 섬유증은 폐 섬유증 연구를 위한 잘 확립되고 널리 허용되는 실험 모델입니다. 많은 측면에서 그것은 독성 손상과 관련된 인간 질병의 패턴을 반영합니다.