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한국실험동물학회 뉴스레터	2022년 3월
[질환모델동물] 희귀질환인 파브리병 치료제 개발을 위한 동물모델

희귀질환인 파브리병 치료제 개발을 위한 동물모델 KMEDI hub 대구경북첨단의료산업진흥재단 위갑인, gabbine@kmedihub.re.kr 매년 2월 마지막날은 세계희귀질환의 날이다. 희귀질환에 대한 사회적 인식을 제고하기 위해 만들어진 날로 우리나라를 비롯한 세계 80여개 국가에서 희귀질환환자들을 위한 다양한 행사를 개최하고 있다. 희귀질환은 80% 이상이 선천적 유전질환으로 조기진단이 어렵고 적절한 치료방법과 치료의약품이 개발되어있지 않아 증상이 발현되는 어린아이들 가운데 약 30%가 5세 이전에 사망하고 증상이 즉시 발현되지 않는다 하더라도 인생전반에 걸쳐 존재하며 평생 고통을 수반한다. 이글을 통해 조금이나마 희귀질환치료제 개발에 대한 관심과 전임상연구를 위한 다양한 동물모델의 개발이 이루어졌으면 하는 바램이다. 이번에 소개해드릴 희귀질환은 lysosomal storage disease (LSD)의 일종인 파브리병으로, 먼저 lysosomal storage disease (LSD)는 세포소기관인 리소좀내 탄수화물, 핵산, 단백질, 지질 등을 분해하는 효소가 결핍되어 발생하는 단일 유전자 이상에 의한 유전질환이다. 분해 효소중 하나가 부족하여 그 기능을 제대로 수행하지 못하면 분해되어야 할 물질이 오래 축척돼 각종 대사성 장애를 유발하고 체내 주요장기에 손상을 입힐 수 있다. 심각한 경우 심장, 신장 및 뇌 손상으로 진행되어 사망에까지 이르게 된다. 이 질환은 신생아부터 성인까지 언제든 발병할 수 있는데, 환자가 워낙 드물고 다앙한 의심증상이 나타나기 때문에 타 질환과 혼동 가능성이 있어 진단 및 치료가 늦어질 수 있다. 현재까지 효소의 종류에 따라 70여종의 대사질환으로 분류되는데 고셔병, 파브리병, 헌터병 등이 대표적이다. LSD 대표 질환중 하나인 스핑고리피드증의 발병 모식도 이들 질환중 파브리병치료제 개발에 대한 연구가 카이스트 한용만 교수 연구팀을 중심으로 아래그림에서와 같이 하나의 플랫폼으로 이루어지고 있으며 본 연구팀은 마우스 파브리질환모델의 개발과 전임상연구를 통한 유효성 평가를 담당하고 있다. 전임상연구가 마무리되면 희귀질환치료제 개발에 관심이 많은 비엘엔에이치와 아산병원을 중심으로 임상시험이 진행되어 신약개발을 완료할 계획이다. 또한 구축된 플랫폼을 이용하여 고셔병, rasopathy 증후군의 일종인, CFC, Noonan, Costello 증후군과 같은 또 다른 희귀질환 치료제 개발도 진행할 수 있을것으로 기대하고 있고, 이에 맞춰 본 연구팀에서는 동물모델을 구축중에 있다. 희귀질환 치료제 개발을 위한 산학연병 협력 플랫폼 파브리병은 α-galactosidase(GLA)라는 효소의 결핍으로 인해 세포내 리소좀에 globotriaosylceramide(Gb3) 라는 당지질이 축척되어 시간이 지나면서 인체의 모든 혈관벽의 통로를 좁게하여 혈류와 영양공급을 감소시키며, 특히 심장, 신장, 피부, 신경계의 미세한 혈관에 영향을 미치는 질환으로 유년기, 청년기의 환자는 주로 남성에서 발병이 되는데 초기증상으로 말단감각이상, 혈관각화종, 발한감소, 급성복통, 각막혼탁, 청각장애, 경한 단백뇨의 증상을 겪으며 병이 진행됨에 따라 30~40대에 이르러 신부전, 심부전, 심혈관계질환, 뇌혈관 이상의 심각한 증상으로 발전한다. 현재의 치료법은 Fabrazyme 이라는 효소를 처리하여 리소좀내에 축적되어 있는 Gb3를 제거하는 효소대체요법(enzyme replacement theraphy, ERT)으로 통증을 완화시킴으로써 환자의 삶의 질을 향상시키고 있지만 손상된 혈관을 복구시키는 데까지는 영향을 못미쳐 결국 신부전이나 심혈관계질환으로 발전하는 병의 진행을 막지는 못하고 있다. 카이스트 연구팀에 따르면 이러한 현상은 리소좀내 Gb3가 축척이 되면 oxidative stress에 의해 trombospondin1 (TSP1) 이라는 단백질이 과발현되어 TGF-β 신호전달체계를 활성화시킴으로써 혈관의 손상을 유발하는 데, 치료제인 fabrazyme을 처리해도 과발현된 TSP1이 지속적으로 유지되기 때문에 혈관손상은 회복하지 못하고 계속 진행된다고 보고하였다. 파브리병의 발병기전과 TSP1의 증가에 따른 혈관손상 모식도 따라서 본 연구팀은 이러한 발병원리에 착안하여 GLA 유전자가 녹아웃된 마우스에 TSP1이 과발현시키면 좀더 사람의 병증에 가까운 질환모델을 만들 수 있지 않을까 하는 아이디어를 가지고 아래와 같이 double transgenic 마우스를 제작하였다. 먼저 GLA 유전자 녹아웃 마우스는 Exon 1 번을 타겟으로 CRISPR/Cas9 시스템을 이용하여 제작하였고, TSP1 과발현마우스는 CAG 프로모터하에서 human TSP1 유전자가 발현될 수 있도록 벡터를 디자인하여 제작한 후 두 마우스의 교배를 통해 double Tg 라인을 구축하였다. 그 결과 GLA 유전자가 녹아웃된 마우스 조직에서 GLA의 활성이 크게 감소한 것을 볼 수 있었고, TSP1 유전자 과발현마우스에서는 정상 개체에 비해 약 8배 정도 증가하였다. 형질전환마우스 제작, 발현분석 및 double Tg 라인구축 A: GLA 유전자 녹아웃 마우스 제작, B: hTSP1 유전자 과발현마우스 제작, C: double Tg 마우스 유전형 분석, D: α-Galactosidase 활성측정, E: TSP1 유전자 mRNA 발현측정 병증분석을 위해 6개월~12개월령 사이의 마우스에서 드물게 생식기 이상과 눈의 각막이 혼탁된 개체가 발견되었고, 체중은 6개월령에는 GLA KO와 double Tg 에서 감소하는 경향을 보였으나 12개월령의 마우스에서는 비슷한 체중으로 회복되었다. 심장초음파 측정에서 좌심실 후벽두께의 증가에 따른 좌심실비대와 좌심실 수축능의 저하가 관찰됨으로서 심부전의 증후를 볼 수 있었다. 파브리병 초기 증상의 하나인 발한의 감소도 마우스 발바닥에서 관찰되었다. 파브리병 마우스에서 병증분석 A: 생식기 이상과 안구 혼탁관찰, B: 발한 측정, C: 6 개월령 체중, D: 12 개월령 체중, E : 좌심실 구혈률, F: 좌심실 분획단축률, G: 좌심실 질량 지금까지의 보고에 따르면 파브리병 마우스모델에서는 대부분의 조직에서 시간이 경과함에 따라 Gb3의 축적이 증가한 반면, 혈관내피세포에서의 Gb3의 축적은 아주 미약하여 혈관손상에 영향을 주지 못한다고 하였다. 이는 사람과 마우스에서 생성되는 HDL/LDL의 비율이 생리학적으로 다르기 때문이며, 우리의 결과에서도 6개월령의 마우스에서 GLA KO 마우스에서 TSP1의 증가가 관찰되지 않은것으로 보아 이러한 이론을 뒷받침한다. 따라서 인위적으로 TSP1의 발현을 증가시켜 마우스 혈관병증을 유발하려는 우리의 계획이 틀리지 않았음을 시사한다. 현재 본 연구팀은 double Tg 마우스에서 혈관병증에 대해 좀 더 연구를 진행중에 있으며 카이스트에서 스크리닝된 파브리병 치료후보물질을 파브리병 마우스에 투여하여 그 효능을 검증하고 있다. 참고문헌 1. Step1.medbullets.com/biochemistry/102080/lysosome 2. Enhanced thrombospondin-1 causes dysfuntion of vascular endothelial cells derived from Fabry diseas-induced pluripotent stem cells. Hyo-Sang Do, Sang-Wook Park, Ilkyun Im, ......, Beom-Hee Lee, Yong-Mahn Han. EBioMedicine. 2020 Feb:52:102633. 3. α-Galactosidase A Knockout Mice.Progressive Organ Pathology Resembles the Type 2 Later-Onset Phenotype of Fabry Disease. Dinesh S. Bangari, Karen M. Ashe,......, John Marshall, and Beth L. Thurberg. The American Journal of Pathology, Vol. 185, No. 3, March 2015.

희귀질환인 파브리병 치료제 개발을 위한 동물모델

KMEDI hub 대구경북첨단의료산업진흥재단

위갑인, gabbine@kmedihub.re.kr

매년 2월 마지막날은 세계희귀질환의 날이다. 희귀질환에 대한 사회적 인식을 제고하기 위해 만들어진 날로 우리나라를 비롯한 세계 80여개 국가에서 희귀질환환자들을 위한 다양한 행사를 개최하고 있다. 희귀질환은 80% 이상이 선천적 유전질환으로 조기진단이 어렵고 적절한 치료방법과 치료의약품이 개발되어있지 않아 증상이 발현되는 어린아이들 가운데 약 30%가 5세 이전에 사망하고 증상이 즉시 발현되지 않는다 하더라도 인생전반에 걸쳐 존재하며 평생 고통을 수반한다. 이글을 통해 조금이나마 희귀질환치료제 개발에 대한 관심과 전임상연구를 위한 다양한 동물모델의 개발이 이루어졌으면 하는 바램이다.

이번에 소개해드릴 희귀질환은 lysosomal storage disease (LSD)의 일종인 파브리병으로, 먼저 lysosomal storage disease (LSD)는 세포소기관인 리소좀내 탄수화물, 핵산, 단백질, 지질 등을 분해하는 효소가 결핍되어 발생하는 단일 유전자 이상에 의한 유전질환이다. 분해 효소중 하나가 부족하여 그 기능을 제대로 수행하지 못하면 분해되어야 할 물질이 오래 축척돼 각종 대사성 장애를 유발하고 체내 주요장기에 손상을 입힐 수 있다. 심각한 경우 심장, 신장 및 뇌 손상으로 진행되어 사망에까지 이르게 된다. 이 질환은 신생아부터 성인까지 언제든 발병할 수 있는데, 환자가 워낙 드물고 다앙한 의심증상이 나타나기 때문에 타 질환과 혼동 가능성이 있어 진단 및 치료가 늦어질 수 있다. 현재까지 효소의 종류에 따라 70여종의 대사질환으로 분류되는데 고셔병, 파브리병, 헌터병 등이 대표적이다.

LSD 대표 질환중 하나인 스핑고리피드증의 발병 모식도

이들 질환중 파브리병치료제 개발에 대한 연구가 카이스트 한용만 교수 연구팀을 중심으로 아래그림에서와 같이 하나의 플랫폼으로 이루어지고 있으며 본 연구팀은 마우스 파브리질환모델의 개발과 전임상연구를 통한 유효성 평가를 담당하고 있다. 전임상연구가 마무리되면 희귀질환치료제 개발에 관심이 많은 비엘엔에이치와 아산병원을 중심으로 임상시험이 진행되어 신약개발을 완료할 계획이다. 또한 구축된 플랫폼을 이용하여 고셔병, rasopathy 증후군의 일종인, CFC, Noonan, Costello 증후군과 같은 또 다른 희귀질환 치료제 개발도 진행할 수 있을것으로 기대하고 있고, 이에 맞춰 본 연구팀에서는 동물모델을 구축중에 있다.

희귀질환 치료제 개발을 위한 산학연병 협력 플랫폼

파브리병은 α-galactosidase(GLA)라는 효소의 결핍으로 인해 세포내 리소좀에 globotriaosylceramide(Gb3) 라는 당지질이 축척되어 시간이 지나면서 인체의 모든 혈관벽의 통로를 좁게하여 혈류와 영양공급을 감소시키며, 특히 심장, 신장, 피부, 신경계의 미세한 혈관에 영향을 미치는 질환으로 유년기, 청년기의 환자는 주로 남성에서 발병이 되는데 초기증상으로 말단감각이상, 혈관각화종, 발한감소, 급성복통, 각막혼탁, 청각장애, 경한 단백뇨의 증상을 겪으며 병이 진행됨에 따라 30~40대에 이르러 신부전, 심부전, 심혈관계질환, 뇌혈관 이상의 심각한 증상으로 발전한다. 현재의 치료법은 Fabrazyme 이라는 효소를 처리하여 리소좀내에 축적되어 있는 Gb3를 제거하는 효소대체요법(enzyme replacement theraphy, ERT)으로 통증을 완화시킴으로써 환자의 삶의 질을 향상시키고 있지만 손상된 혈관을 복구시키는 데까지는 영향을 못미쳐 결국 신부전이나 심혈관계질환으로 발전하는 병의 진행을 막지는 못하고 있다. 카이스트 연구팀에 따르면 이러한 현상은 리소좀내 Gb3가 축척이 되면 oxidative stress에 의해 trombospondin1 (TSP1) 이라는 단백질이 과발현되어 TGF-β 신호전달체계를 활성화시킴으로써 혈관의 손상을 유발하는 데, 치료제인 fabrazyme을 처리해도 과발현된 TSP1이 지속적으로 유지되기 때문에 혈관손상은 회복하지 못하고 계속 진행된다고 보고하였다.

파브리병의 발병기전과 TSP1의 증가에 따른 혈관손상 모식도

따라서 본 연구팀은 이러한 발병원리에 착안하여 GLA 유전자가 녹아웃된 마우스에 TSP1이 과발현시키면 좀더 사람의 병증에 가까운 질환모델을 만들 수 있지 않을까 하는 아이디어를 가지고 아래와 같이 double transgenic 마우스를 제작하였다. 먼저 GLA 유전자 녹아웃 마우스는 Exon 1 번을 타겟으로 CRISPR/Cas9 시스템을 이용하여 제작하였고, TSP1 과발현마우스는 CAG 프로모터하에서 human TSP1 유전자가 발현될 수 있도록 벡터를 디자인하여 제작한 후 두 마우스의 교배를 통해 double Tg 라인을 구축하였다. 그 결과 GLA 유전자가 녹아웃된 마우스 조직에서 GLA의 활성이 크게 감소한 것을 볼 수 있었고, TSP1 유전자 과발현마우스에서는 정상 개체에 비해 약 8배 정도 증가하였다.

형질전환마우스 제작, 발현분석 및 double Tg 라인구축

A: GLA 유전자 녹아웃 마우스 제작, B: hTSP1 유전자 과발현마우스 제작, C: double Tg 마우스 유전형 분석,
D: α-Galactosidase 활성측정, E: TSP1 유전자 mRNA 발현측정

병증분석을 위해 6개월~12개월령 사이의 마우스에서 드물게 생식기 이상과 눈의 각막이 혼탁된 개체가 발견되었고, 체중은 6개월령에는 GLA KO와 double Tg 에서 감소하는 경향을 보였으나 12개월령의 마우스에서는 비슷한 체중으로 회복되었다. 심장초음파 측정에서 좌심실 후벽두께의 증가에 따른 좌심실비대와 좌심실 수축능의 저하가 관찰됨으로서 심부전의 증후를 볼 수 있었다. 파브리병 초기 증상의 하나인 발한의 감소도 마우스 발바닥에서 관찰되었다.

파브리병 마우스에서 병증분석

A: 생식기 이상과 안구 혼탁관찰, B: 발한 측정, C: 6 개월령 체중, D: 12 개월령 체중,
E : 좌심실 구혈률, F: 좌심실 분획단축률, G: 좌심실 질량

지금까지의 보고에 따르면 파브리병 마우스모델에서는 대부분의 조직에서 시간이 경과함에 따라 Gb3의 축적이 증가한 반면, 혈관내피세포에서의 Gb3의 축적은 아주 미약하여 혈관손상에 영향을 주지 못한다고 하였다. 이는 사람과 마우스에서 생성되는 HDL/LDL의 비율이 생리학적으로 다르기 때문이며, 우리의 결과에서도 6개월령의 마우스에서 GLA KO 마우스에서 TSP1의 증가가 관찰되지 않은것으로 보아 이러한 이론을 뒷받침한다. 따라서 인위적으로 TSP1의 발현을 증가시켜 마우스 혈관병증을 유발하려는 우리의 계획이 틀리지 않았음을 시사한다.

현재 본 연구팀은 double Tg 마우스에서 혈관병증에 대해 좀 더 연구를 진행중에 있으며 카이스트에서 스크리닝된 파브리병 치료후보물질을 파브리병 마우스에 투여하여 그 효능을 검증하고 있다.

참고문헌

1. Step1.medbullets.com/biochemistry/102080/lysosome

2. Enhanced thrombospondin-1 causes dysfuntion of vascular endothelial cells derived from Fabry diseas-induced pluripotent stem cells. Hyo-Sang Do, Sang-Wook Park, Ilkyun Im, ......, Beom-Hee Lee, Yong-Mahn Han. EBioMedicine. 2020 Feb:52:102633.

3. α-Galactosidase A Knockout Mice.Progressive Organ Pathology Resembles the Type 2

Later-Onset Phenotype of Fabry Disease. Dinesh S. Bangari, Karen M. Ashe,......, John Marshall, and Beth L. Thurberg. The American Journal of Pathology, Vol. 185, No. 3, March 2015.

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